引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析ppt課件(已修改)
2025-05-11 01:58 本頁(yè)面
【正文】 引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析 引物設(shè)計(jì)基本原則 ? 引物長(zhǎng)度（ primer length） ? 產(chǎn)物長(zhǎng)度（ product length） ? 序列 Tm值 (melting temperature) ? G+C含量（ position） ? 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) （ duplex formation and hairpin） ? 閱讀框 1. 引物的長(zhǎng)度 一般為 1830bp，常用的是20bp左右，但不能大于 38bp，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于 72℃ ，即 Taq酶的最適溫度 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在普通 PCR以 200～ 500為宜；實(shí)時(shí)熒光 PCR則為 50～ 150bp。 3. 引物溶解溫度（ Tm值） 引物的 Tm值一般控制在 5560度 , 盡可能保證上下游引物的 Tm值一致 ,一般不超過(guò) 2度 . 如果引物中的 G+C含量相對(duì)偏低 ,則可以使引物長(zhǎng)度稍長(zhǎng) ,而保證一定的退火溫度 . Tm=2(A+T)+4(C+G) 4. 引物的 GC含量 有效引物中 (G+C)的比例為4060%，過(guò)高（ 非特異性擴(kuò)增 0或過(guò)低（ 擴(kuò)增效率不高） 都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的 GC含量不能相差太大。 5. 引物自身 引物間 3’ 端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致 PCR反應(yīng)失敗 。 引物 3’ 端堿基，最好為 G或 C，形成 GC夾子，提高引發(fā)效率，并提高擴(kuò)增的特異性 任務(wù) 用綠色熒光蛋白 (GFP)標(biāo)記蛋白 NR1 SP NR1 Plasmid 1: Plasmid 2 GFP SP BamHI NR1 Plasmid 1: Plasmid 2 GFP SP BamHI(GGATCC) NR11a GFP 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc ca
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