【正文】 . . . . .細胞生物學實驗手冊前 言 這本實驗教材是為高等醫(yī)學院校細胞生物學教學編寫的，適用于五年制本科、七年制臨床專業(yè)和研究生班。 細胞生物學實驗課的教學目的，主要是通過基本技能訓練以及觀察分析實驗結果，使學生了解并掌握有關的實驗技術原理和操作方法，進而培養(yǎng)學生動手實踐、觀察分析和解決問題的能力。為達到此目的，實驗內容自成體系，著眼于加強學生的基末技能訓練，以及觀察分析問題和科學思維能力的培養(yǎng)。大多數實驗采用生活細胞材料，由學生自己動手取材和實驗，使學生能對細胞獲得生動的認識。選編了一些生物醫(yī)學常用的細胞生物學基本實驗，如細胞的顯微測量、細胞活力測定、細胞計數、細胞組分的分級分離、細胞組分的化學反應、細胞生理活動、細胞染色體技術、細胞培養(yǎng)、細胞融合、免疫熒光技術、電鏡技術等，為后續(xù)的課程及醫(yī)學研究打下一定基礎。 全書內容共23個實驗，五年制本科、七年制醫(yī)學專業(yè)和研究生班教學根據具體情況選擇基本實驗，由學生自己動手操作，少數應用大型精密儀器的實驗進行參觀示教，另附實驗報告一冊。 本教材由王蕓慶主編、謝榮林副主編，參加編寫的有陳興、謝榮林、寧剛、劉冬杰、黃東陽、紀曉輝、時偉紅、朱亞勤、黃集前、王明武、畢衛(wèi)真、張婕、三維琴和王世藩。荊永顯、李虹、王序繪制插圖，畢衛(wèi)真負責印刷出版事宜。 教材初稿曾于1989年《全國醫(yī)學細胞生物學實驗課培訓班》試用，參加該班的教師提出許多寶貴的經驗及修改意見，謹此致謝?，F在第四版在1993年第三版基礎上對部分實驗進行了補充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的顯示”實驗。由于經驗不足，水平有限，本教材一定還有很多缺點和錯誤，敬請使用者批評指正。 目 錄前 言 實驗室規(guī)則……………………………………………………………… (1) 常用實驗動物了解和解剖器械的使用………………………………… (2) 細胞生物學實驗繪圖方法與要求………………………………………（4）實驗 一 動物細胞的基本形態(tài)觀察和顯微測量…………………………………（5）實驗 二 線粒體的活體染色及電鏡照片觀察……………………………………（8）實驗 三 液泡系的活體染色及電鏡照片觀察……………………………………（10）實驗 四 細胞中微絲的染色及微絲與細胞形態(tài)的實驗觀察…………………… (11)實驗 五 細胞器的光鏡切片和電鏡照片觀察……………………………………（13）實驗 六 細胞生理活動的觀察……………………………………………………（16）實驗 七 細胞組分的化學反應……………………………………………………（20）實驗 八 細胞核與線粒體的分級分離……………………………………………（23）實驗 九 細胞分裂的形態(tài)觀察……………………………………………………（26）實驗 十 正常細胞與腫瘤細胞常規(guī)核型的標本制備…………………………… (31)實驗十一 細胞融合…………………………………………………………………（36）實驗十二 應用細胞融合技術制備染色體提前凝集標本…………………………（38）實驗十三 培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數……………………………………………（40）實驗十四 細胞的原代和傳代培養(yǎng)…………………………………………………（43）實驗十五 酸性磷酸酶的顯示………………………………………………………（46）實驗十六 腫瘤細胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)和測定……………………………………（48）實驗十七 電鏡生物標本的制備及鏡下觀察………………………………………（50）實驗十八 整裝培養(yǎng)細胞生物膜系統的光鏡和透射電鏡標本制備與觀察………（54）實驗十九 免疫熒光抗體法檢查細胞表面抗原……………………………………（56）實驗二十 姊妹染色單體互換標本制備與分析……………………………………（58）實驗二十一 銀染核仁形成區(qū)的光鏡和電鏡標本制備及觀察…………………… (60)實驗二十二 染色體掃描電鏡標本制備及觀察……………………………………（63）實驗二十三 細胞顯微攝影…………………………………………………………（65） 附錄一 離心機轉數與離心力的換算表………………………………（67） 附錄二 溶液的配制……………………………………………………（68） 主要參考資料……………………………………………………………（77）實驗室規(guī)則 一、遵守實驗紀律，按時到達實驗室，不得遲到或早退。實驗中途因故需外出時應向任 課教師請假。 二、進入實驗室之前要換好白大衣及拖鞋。 三、保持實驗室安靜，不許在實驗室內大聲喧嘩及隨意走動。 四、必須嚴肅認真地進行實驗。實驗期間不得進行任何與實驗無關的活動。 五、實驗室內各組儀器及器材由各組自已使用，不得互相調換。要愛護儀器、標本和設 備。如遇儀器損壞或不靈，應及時報告任課教師，以便修理或更換，不要自行亂修。 損壞器材或設備者應按有關規(guī)定進行賠償。 六、注意節(jié)約實驗材料、藥品和水、電等。 七、保持實驗室內清潔整齊。實驗結束后，各組必須認真清理各自的實驗臺面，將器材 清洗后點清數目，然后擺放整齊。班級值日生負責清掃室內衛(wèi)生，關好水、電開關 和門、窗等，經教師允許后方可離開實驗室。 八、動物尸體、紙片及實驗廢物應放到指定地點，不得隨意亂丟。九、有不遵守上述要求者，任課老師將終止其實驗，并取消其當堂實驗成績。常用實驗動物的了解和解剖器械的使用 一、常用實驗動物 常用的實驗動物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、貓、兔和狗等。在醫(yī)學實驗中，常常根據不同的實驗目的而選用不同的動物進行實驗研究。例如，蟾蜍可以用于觀察離體心臟搏動情況的實驗，小白鼠常用于樣本很大的實驗(如藥物的半數致死量的測定等)，貓常用于測定腦內電位的實驗，而狗是局解手術中常用的實驗動物。 在我們細胞生物學實驗中，除應用培養(yǎng)細胞外，最常用的動物是蟾蜍和小白鼠，下面對其特點及基本處置做一簡單的介紹。 蟾蜍 蟾蜍是兩棲類動物，由于其取材方便，常用于各種實驗。其細胞較哺乳類動物的細胞大得多，因此常用于觀察細胞形態(tài)的實驗。 1．雌雄鑒別 通常雄性蟾蜍較雌性的為小，且在其前肢的l～3趾基部有被稱為婚墊的黑疣。 2．捉拿及處死方法： 常用搗髓法處死蟾蜍，即用解剖針搗毀其腦組織和脊髓。具體方法是，左手握住蟾蜍的身體和四肢，使其腹部貼著掌心，食指壓住蟾蜍頭部前端使其盡量腹屈。在頭與軀干之間可觸及一凹陷(即枕骨大孔所在處)，右手持解剖針直插入此凹陷約l～2mm，隨即將針尖轉向頭側插入顱腔搗毀腦組織。然后將解剖針抽回并轉向尾側刺入脊椎管內搗毀其脊髓。如此直至其四肢松軟，呼吸消失為止。 小白鼠 小白鼠是哺乳動物，是最為常用的實驗動物。 1．捉拿方法： 將小白鼠放在鼠籠蓋鐵網上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠則會盡力向前蹬。用左手的拇指和食指抓住其頭頂部皮膚，然后用左手小指與手掌之間夾住其尾巴。 2．處死方法： 處死應以安樂死為原則，即使之無痛苦而迅速死亡。常用的方法有頸椎脫位法，斷頭法和二氧化碳吸入法等。斷頭法需用特殊的斷頭器，二氧化碳吸入法則將小鼠放入盛有二氧化碳的容器內即可。頸椎脫位法的具體方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的頭部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其頸椎脫位而立即死亡。 3．給藥方法： 小自鼠的給藥途徑有經口給藥、腹腔內注射、尾靜脈注射、皮下注射、皮內注射和肌肉注射等。我們常用的是腹腔注射。具體方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中線稍外側(避開膀胱和血管)用酒精消毒后，首先將注射針頭向頭部方向刺入皮下，進針1～2mm后，再以45176。角刺穿腹部肌肉而進入腹腔(刺穿腹肌時有一落空感)。針頭刺入腹腔后切勿左右擺動，以免損傷腸管或肝臟?！?0克體重。 二、常用手術器械及操作方法： 1．解剖針：用于挑、刺等。常用來搗髓處死蟾蜍，持法如執(zhí)筆法。 2．解剖刀(即外科手術刀)：用于各種皮膚切口和組織切除等。持法有執(zhí)弓法與執(zhí)筆法兩種。前者用于較大力量切開較長距離的堅韌的組織，如大動物的皮膚切口等；后者則用于小力量的短距離切開，或分離皮膚和肌肉等。 3．大剪刀：用于剪毛、皮膚、皮下組織和肌肉等。持法如圖。 4．眼科剪刀：用于剪斷神經、血管、筋膜等細軟組織。 5．眼科鑷子：用于提取神經、血管和筋膜等細軟組織。 6．鈍頭鑷子：用于提取臟器、組織等。 7．有鉤鑷子：用于提取皮膚切口等。 常用手術器械執(zhí)手術刀的姿勢執(zhí)手術剪的姿勢執(zhí)手術鑷的姿勢執(zhí)手術刀、手術剪、手術鑷的姿勢(張之曾編)細胞生物學實驗繪圖方法與要求一、在仔細觀察的基礎上，選擇典型結構進行描繪，要求真實、準確(注意各部結構的比例關系)。二、用鉛筆繪圖，線條要明確清晰，圖的深淺明暗一律以點的疏密來表示，點要圓而一致，不得涂暗影或進行其它美術加工。 三、各部結構名稱要在一側引直線注明。各引線要平行不得交叉。四、每幅圖的大小、位置在紙面上必須安排得當并注意紙面的整潔。實驗一 動物細胞的基本形態(tài)觀察和顯微測量【實驗目的】 制備不同細胞的臨時制片，觀察、了解細胞的基本形態(tài)，學會使用測微尺，通過測量對紅細胞的進化進行分析。【實驗用品】一、材料和標本 蟾蜍一只，人血液一滴。 二、器材和儀器 配有目鏡測微尺的顯微鏡一臺、載片十張、蓋片三張、吸水紙、手術器材一套、解剖盤一個、鏡臺測微尺一個、小平皿一個、牙簽。 三、試劑 1％甲苯胺蘭、1％甲基蘭、Ringer氏液(兩棲類用)?！緦嶒瀮热荨? 一、細胞的基本形態(tài)觀察 (一)原理 細胞的形態(tài)結構與功能相關是很多細胞的共同特點，在分化程度較高的細胞更為明顯，這種合理性是生物漫長進化過程所形成的。例如：具有收縮機能的肌細胞伸展為細長形；具有感受刺激和傳導沖動機能的神經細胞有長短不一的樹枝狀突起；游離的血細胞為圓形、橢圓形或圓餅形。 不論細胞的形狀如何，細胞的結構一般分為三大部分：細胞膜、細胞質和細胞核。但也有例外。例如：哺乳類紅細胞成熟時細胞核消失。 (二)觀察方法與結果 1．制備蟾蜍脊髓壓片觀察脊髓前角運動神經細胞。 取蟾蜍一只，破壞腦和脊髓，在口裂處剪去頭部，除去延腦，剪開椎管，可見乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿內，用Ringer氏液洗去血液后放在載片上，剪碎。將另一載片壓在脊髓碎塊上，用力擠壓。將上面的載片取下即可得到壓片。在壓片上滴一滴甲苯胺蘭染液，染色10分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液。在顯微鏡下觀察，染色較深的小細胞是神經膠質細胞。染成蘭紫色的、大的、有多個突起的細胞是脊髓前角運動神經細胞，胞體呈三角形或星形，中央有一個圓形細胞核，內有一個核仁(參照照片)。 2．蟾蜍骨骼肌細胞的剝離與觀察 剪開蟾蜍腿部皮膚，剪下一小塊肌肉，放在載片上，用鑷子和解剖針剝離肌肉塊成為肌束，繼續(xù)剝離，可得到很細的肌纖維(肌細胞)。盡可能拉直肌纖維。在顯微鏡下觀察，肌細胞為細長形，可見折光不同的橫紋，每個肌細胞有多個核，分布于細胞的周邊(參照照片)。 3．蟾蜍肝臟壓片的制備與觀察剪開蟾蜍腹腔，取一小塊(約2～3mm 3)肝放在平皿內，用Ringer氏液洗凈，用鑷子輕壓將肝中的血擠出。然后放在載片上，制片方法同脊髓壓片。染色用甲基蘭。顯微鏡下觀察可見肝細胞核染成蘭色，肝細胞緊密排列，擠成多角形(參照照片)。 4．蟾蜍血涂片的制備與觀察 取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在載片上．將另一載片的一端呈45176。角緊貼在血滴的前緣，均勻用力向前推，使血液在載片上形成均勻的薄層。(圖l一1)。晾干。顯微鏡觀察可見蟾蜍紅細胞為橢球形，有核。白細胞數目少，為圓形。圖1—1血涂片的制備 5．人血涂片的制備與觀察 取人血一滴，制片方法同上。顯微鏡觀察可見人紅細胞為凹圓盤形，無核。自細胞數目少，為圓形。 6．人口腔上皮細胞標本的制備與觀察 用牙簽刮取口腔上皮細胞均勻地涂在載片上(不可反復涂沫)，滴一滴甲苯胺蘭染液，染色5分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液。顯微鏡下觀察可見復蓋口腔表面的上皮細胞為扁平橢圓形，中央有橢圓形核，染成蘭色。 二、測微尺的使用 (一)原理 測微尺分目鏡測微尺和鏡臺測微尺，兩尺配合使用。目鏡測微尺是一個放在目鏡像平面上的玻璃圓片。圓片中央刻有一條直線，此線被分為若干格，每格代表的長度隨不同物鏡的放大倍數而異。因此，用前必須測定。鏡臺測微尺是在一個載片中央封固的尺，長1毫米(1000μm)，被分為100格，每格長度是10微米。 (二)方法 1．將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上夾好，小心轉動目鏡測微尺和移動鏡臺測微尺使兩尺平行，記錄鏡臺測微尺若干格所