【正文】 發(fā)酵綜合實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書 前 言 一、課程的性質(zhì)與任務(wù) 《發(fā)酵綜合實(shí)驗(yàn)》是生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)的一門專業(yè)基礎(chǔ)必修實(shí)踐類課程?！栋l(fā)酵綜合實(shí)驗(yàn)》課程作為發(fā)酵工程教學(xué)的重要部分，一直是課程建設(shè)的重點(diǎn)，在實(shí)現(xiàn)學(xué)生總體培養(yǎng)目標(biāo)中占有重要地位。本課程著重培養(yǎng)學(xué)生的專業(yè)核心技能，通過本課程的開展可以培養(yǎng)學(xué)生對發(fā)酵等工業(yè)的興趣及將來從事發(fā)酵生產(chǎn)的能力。由于到目前為止，國內(nèi)雖已有一些關(guān)于發(fā)酵工程的教材或?qū)Ｖ?，但多偏重于介紹基本原理及相關(guān)應(yīng)用，還欠缺實(shí)驗(yàn)操作方面的有關(guān)教材，尤其缺少高職層次的相關(guān)教材，此外，目前不同學(xué)校的生物技術(shù)及 應(yīng)用專業(yè)教學(xué)都有不同的側(cè)重點(diǎn)和方向性，所以沒有一本特別合適本專業(yè)《發(fā)酵綜合實(shí)驗(yàn)》課程與我院學(xué)生特點(diǎn)的教程，因此根據(jù)輕工業(yè)高等專業(yè)學(xué)校生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)發(fā)酵方向《發(fā)酵綜合實(shí)驗(yàn)》教學(xué)大綱編寫適用講義。本講義以我院生化工程系生物技術(shù)專業(yè)學(xué)生為服務(wù)對象，知識點(diǎn)與學(xué)生實(shí)際層次吻合，便于學(xué)生將有關(guān)發(fā)酵基本的實(shí)驗(yàn)技能真正掌握，能為后繼專業(yè)課學(xué)習(xí)及從事相關(guān)工作打下扎實(shí)的基礎(chǔ)。 《發(fā)酵綜合實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書》在內(nèi)容上涵蓋了發(fā)酵工程的諸多新領(lǐng)域，與學(xué)科的發(fā)展相適應(yīng)，激發(fā)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣。實(shí)驗(yàn)安排上，首先通過精心選擇、安排基本技能訓(xùn)練的 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，做到少而精，便于學(xué)生掌握，而且在進(jìn)一步在綜合實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中，這些基本技能訓(xùn)練重復(fù)出現(xiàn)，基本技能得到了鞏固和加強(qiáng)；其次，以大小、難易等不同項(xiàng)目為教學(xué)單元，增加了綜合性、設(shè)計性的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。通過實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)化的訓(xùn)練，學(xué)生的動手能力、綜合問題的分析能力得到極大的提高，對于專業(yè)核心技能的掌握也有大量的提高，并在實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)學(xué)生的團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力、調(diào)查分析能力、查閱資料能力、方案設(shè)計能力及創(chuàng)造性思維等，使學(xué)生的知識體系更加合理化、系統(tǒng)化。 《發(fā)酵綜合實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書》按照兩個層次編制實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： (1)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) ：將發(fā)酵過程按工藝流 程整合成培養(yǎng)基配制、菌種誘變、種子擴(kuò)培、發(fā)酵培養(yǎng)、產(chǎn)物分析等單元實(shí)驗(yàn)?zāi)K，與理論課程同步開設(shè)，作為課程實(shí)驗(yàn)的基本環(huán)節(jié)。 (2)綜合實(shí)驗(yàn) ：指具有綜合度并帶有一定設(shè)計性的大實(shí)驗(yàn)，是課程實(shí)驗(yàn)的提高環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涵蓋實(shí)際生物產(chǎn)品生產(chǎn)及過程控制檢測等內(nèi)容，學(xué)生可以結(jié)合自己的興趣選做其中部分內(nèi)容。 本講義最主要的特點(diǎn)是以實(shí)踐性環(huán)節(jié)為中心內(nèi)容，只在必要的時候介紹一些必需的理論知識；選材方面，注意將國外該領(lǐng)域的最新實(shí)驗(yàn)技術(shù)與我國現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)材料以及研究方法有機(jī)結(jié)合起來，所選取的這些實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)是科學(xué)研究工作中經(jīng)常應(yīng)用的技術(shù) ，可操作性強(qiáng)；另外，結(jié)合學(xué)生知識基礎(chǔ)和學(xué)習(xí)特點(diǎn)以及現(xiàn)有教學(xué)設(shè)備，合理編排內(nèi)容，學(xué)習(xí)起來更容易，技術(shù)掌握更簡單，方法更實(shí)用。 二、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 第一篇 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 第一章 菌種管理實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第一節(jié) 菌種的分離純化與性能測定 實(shí)驗(yàn)一 厭氧菌的分離和培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)二 土壤中產(chǎn)醋酸菌種的分離篩選 實(shí)驗(yàn)三 酸乳制品中的乳酸菌分離 實(shí)驗(yàn)四 啤酒酵母的分離 實(shí)驗(yàn)五 檸檬酸產(chǎn)生菌的分離 實(shí)驗(yàn)六 啤酒酵母發(fā)酵力的測定 實(shí)驗(yàn)七 酵母菌熱死溫度的測定 實(shí)驗(yàn)八 酵母菌凝集力的測定 第二節(jié) 微生物育種 實(shí)驗(yàn)一 紫外線誘變育種 —— 繪制細(xì)胞存活 率和突變率曲線 實(shí)驗(yàn)二 利用原生質(zhì)體融合選育耐熱性β－淀粉酶產(chǎn)生菌 第二章 生物培養(yǎng)工藝過程實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第一節(jié) 培養(yǎng)基制備實(shí)驗(yàn)技術(shù) 實(shí)驗(yàn)一 啤酒麥芽汁制備實(shí)驗(yàn) 第二節(jié) 發(fā)酵罐的使用方法 實(shí)驗(yàn)一 小型發(fā)酵罐的使用及分批發(fā)酵 第三節(jié) 生物工藝過程實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 淀粉質(zhì)原料酒精發(fā)酵 實(shí)驗(yàn)二 中溫α 淀粉酶的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)三 搖床培養(yǎng)確定菌體培養(yǎng)和營養(yǎng)條件 第三章 發(fā)酵生產(chǎn)過程中的微生物學(xué)檢測 實(shí)驗(yàn)一 原料的檢查 實(shí)驗(yàn)二 曲的檢查（ 醬油種曲孢子數(shù)及發(fā)芽率的測定） 實(shí)驗(yàn)三 酒曲、發(fā)酵醪及成品的檢測 第四章 生物工藝過程相關(guān)參 數(shù)的檢測 第一節(jié) 菌體量的測定 實(shí)驗(yàn)一 微生物菌體量的測定 實(shí)驗(yàn)二 微生物菌體密度的測定 第二節(jié) 容積氧傳遞系數(shù)的測定 實(shí)驗(yàn)一 亞硫酸鹽法測定發(fā)酵罐體積溶氧系數(shù) KLa 第五章 生物物質(zhì)分離與精制實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第一節(jié) 檸檬酸提取 實(shí)驗(yàn)一 檸檬酸提取 第二節(jié) 糖化酶提取 實(shí)驗(yàn)一 糖化酶的發(fā)酵和提取實(shí)驗(yàn) 第六章 生物物質(zhì)成分分析實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第一節(jié) 水分測定 實(shí)驗(yàn)一 烘箱干燥法測水份 第二節(jié) 糖的測定 實(shí)驗(yàn)一 原料中粗淀粉的測定 實(shí)驗(yàn)二 還原糖的測定 第三節(jié) 含氮量的測定 實(shí)驗(yàn)一 氨基酸總量測定 第二篇 綜合實(shí)驗(yàn) 第一章 發(fā)酵工藝過 程綜合實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 淀粉酶解糖液的制備及谷氨酸發(fā)酵罐發(fā)酵 實(shí)驗(yàn)二 毛霉的分離和豆腐乳的制備 實(shí)驗(yàn)三 甜酒釀的制作 實(shí)驗(yàn)四 果酒的制作 實(shí)驗(yàn)五 啤酒的實(shí)驗(yàn)室釀造及代謝曲線的測定 第二章 發(fā)酵產(chǎn)品成分分析綜合實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 小香檳 (汽酒 )中總糖的測定 實(shí)驗(yàn)二 牛乳酸度的測定 實(shí)驗(yàn)三 醬油中山梨酸、苯甲酸的測定 三、教學(xué)組織 本課程的教學(xué)組織主要是在校內(nèi)實(shí)訓(xùn)基地開展發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)分為按照兩個層次，即基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和綜合實(shí)驗(yàn)。 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：將發(fā)酵過程按工藝流程整合成菌種管理實(shí)驗(yàn)技術(shù)、生物培養(yǎng)工藝過程實(shí)驗(yàn)技 術(shù)、發(fā)酵生產(chǎn)過程中的微生物學(xué)檢測、生物工藝過程相關(guān)參數(shù)的檢測、生物物質(zhì)分離與精制實(shí)驗(yàn)技術(shù)、生物物質(zhì)成分分析實(shí)驗(yàn)技術(shù)培養(yǎng)基配制等單元實(shí)驗(yàn)?zāi)K，屬于發(fā)酵基本實(shí)驗(yàn)技能，作為課程實(shí)驗(yàn)的基本環(huán)節(jié)。綜合實(shí)驗(yàn) ：指具有綜合度并帶有一定設(shè)計性的大實(shí)驗(yàn)，是課程實(shí)驗(yàn)的提高環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涵蓋實(shí)際生物產(chǎn)品生產(chǎn)及過程控制檢測等內(nèi)容，學(xué)生可以結(jié)合自己的興趣選做其中部分內(nèi)容。整體內(nèi)容安排是由淺向深的過渡，由基本向綜合的過渡，由基本的小項(xiàng)目向有難度的大項(xiàng)目的過渡，逐步提高能力訓(xùn)練與培養(yǎng)。 實(shí)習(xí)教學(xué)時間為 20 學(xué)時，一般安排在課堂教學(xué) 之后，便于學(xué)生綜合應(yīng)用所學(xué)課堂理論知識到實(shí)際之中，提高分析問題和解決問題的能力，地點(diǎn)在發(fā)酵實(shí)訓(xùn)室，要求學(xué)生分組（人）在指導(dǎo)教師指導(dǎo)下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)操作，并在規(guī)定時間觀察成效，最后寫出相應(yīng)實(shí)驗(yàn)報告。指導(dǎo)教師根據(jù)學(xué)生表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范與否、以及實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)報告水平等綜合評定成績，將其作為課程成績的重要組成部分，并單獨(dú)記載實(shí)驗(yàn)成績。通過實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)，學(xué)生能強(qiáng)化理論知識，學(xué)會綜合運(yùn)用所學(xué)知識解決實(shí)際問題，提高專業(yè)核心能力。 四、實(shí)驗(yàn)課時的分配 實(shí)驗(yàn)： 20 學(xué)時（一周） 第一篇 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 第一篇 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 第一 章 菌種管理實(shí)驗(yàn)技術(shù) 微生物是發(fā)酵的原動力。在發(fā)酵工業(yè)中，要取得生產(chǎn)的高效益，就要有優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。因此，在發(fā)酵生產(chǎn)中，只有獲得一個優(yōu)良的菌種以及提供一套保證該菌種能發(fā)揮最大潛在生產(chǎn)能力的工藝過程，才能獲得發(fā)酵生產(chǎn)的成功。一般需要根據(jù)需要分離出相應(yīng)的菌種，但野生型菌種產(chǎn)量都比較低，不能直接用于生產(chǎn)，現(xiàn)在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中所使用的菌種，幾乎都是經(jīng)過人工選育出來的優(yōu)良菌種。因此，選育優(yōu)良的生產(chǎn)菌種并保持其穩(wěn)定的生產(chǎn)特性，是發(fā)酵工業(yè)中極其重要的工作。 第一節(jié) 菌種的分離與純化 從自然界中分離篩選微生物菌種，是我們獲得 優(yōu)良新菌種最基本、最主要的方法，因此，發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選是一項(xiàng)重要的、長期而繁重的工作。自然界存在著各種各樣的微生物，尤其是土壤中微生物種類齊全，是微生物的大本營。因此可以從土壤中分離到幾乎所有微生物。另外，不同的自然界環(huán)境中生存的微生物優(yōu)勢菌種也不同。各種食品、農(nóng)副產(chǎn)品等營養(yǎng)組成不同，從中可以分離出不同的微生物。發(fā)酵工業(yè)菌種常用的分離源有被污染的生產(chǎn)或科研菌種、生產(chǎn)中長期使用的菌種、發(fā)酵食品用菌種、動物腸道菌群、經(jīng)各種育種方法處理過的微生物材料和自然界菌種樣品。 自然界的微生物是混雜生存的，要從中分理 出一種微生物，不僅需要考慮分離源應(yīng)含有較多數(shù)量的目的菌，還要在分離操作中使之與其他菌種相互分開。對于樣品中含量較低的菌處，要針對其生物學(xué)特點(diǎn)合理設(shè)計分離方法，如富集培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、利用其特殊的生理反應(yīng)產(chǎn)生特定的生長現(xiàn)象等，以便于從大量雜菌中選出目的菌種。 純種分離技術(shù)是微生物學(xué)中重要的基本技術(shù)之一。分離是指從混雜的微生物群體中獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法。純種 (純培養(yǎng) )是指一株菌種或一個培養(yǎng)物中所有的細(xì)胞或孢子都是由一個細(xì)胞分裂，繁殖而產(chǎn)生的后代。微生物的分離與純化技術(shù)主要用于分離具有特殊功能的微生物，優(yōu)良菌種 及純化被污染的菌種等。 從混雜群體中分離特定微生物的常用方法有：控制分離培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、控制培養(yǎng)基的 pH 值、添加抑制劑、控制培養(yǎng)溫度、控制空氣條件、對樣品進(jìn)行特殊處理等。常用的純種分離方法有平板劃線分離法、簡單平板分離法、稀釋分離、涂布分離法、毛細(xì)管分離法、顯微操作單細(xì)胞分離法等。 實(shí)驗(yàn)一 厭氧菌的分離和培養(yǎng) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵? 了解厭氧微生物的生長特性； 觀察厭氧微生物（雙歧桿菌）的形態(tài)特征； 掌握厭氧微生物的滾管分離、培養(yǎng)與計數(shù)技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 目前培養(yǎng)厭氧微生物的簡便而有效的技術(shù) 有：厭氧箱培養(yǎng)技術(shù)；厭氧罐培養(yǎng)技術(shù)；厭氧袋培養(yǎng)技術(shù)；亨蓋特厭氧滾管技術(shù)。這里主要介紹亨蓋特厭氧滾管技術(shù)。 亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美國微生物學(xué)家亨蓋特（ Hungate）于 1950 年首次提出并應(yīng)用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術(shù)。此后這項(xiàng)技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進(jìn)，從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趨完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一整套完整技術(shù)。而且多年來的實(shí)踐已經(jīng)證明它是研究嚴(yán)格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術(shù)。 亨蓋特厭樣滾管培養(yǎng)技術(shù)不僅可用于有益厭氧菌如雙歧桿菌等的分離、與活菌培養(yǎng)計數(shù)，還可以用于有害腐 敗菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭狀芽孢桿菌）的分離與鑒定。 三、實(shí)驗(yàn)材料 樣品 雙歧酸奶（液體）、雙歧桿菌制劑（固體）。 培養(yǎng)基 改良 MRS 培養(yǎng)基， PTYG 培養(yǎng)基。 具體配方如下： （ 1）乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（ MRS） 蛋白胨 g 牛肉膏 g 酵母膏 g 檸檬酸氫二銨 [（ NH4） 2HC6H5O7] g 葡萄糖 (C6H12O6 H2O) g 吐溫 80 mL 乙酸鈉（ CH3COONa 3H2O） g 磷酸氫二鉀（ K2HPO4 3H2O） g 硫酸鎂（ MgSO4 7H2O） g 硫酸錳（ MnSO4 H2O） g 瓊脂 g 蒸餾水 1000 mL pH 115℃高壓滅菌 15～ 20mim 備用。 當(dāng)乳酸菌生長代謝出乳酸后，會使 pH 下降而使顏色由綠變?yōu)辄S綠，也由于pH 值降低再加上抗生素及嚴(yán)氧培養(yǎng)的作用，所以一般的微生物不容易在此培養(yǎng)基上生長，因此十分容易鑒別乳酸菌。 改良 MRS 培養(yǎng)基： MRS 培養(yǎng)基中添加促生長物質(zhì) Y ％，還原劑 B ％。 （ 2） PTYG 培養(yǎng)基 胰蛋白胨 5 g 酵母提取物 10 g 大豆蛋白胨 5 g 葡萄糖 10g 吐溫 80 1 mL 鹽溶液 40mL ％刃天青 l mL 半胱氨酸鹽酸鹽 g 蒸餾水 1000 mL 瓊脂 15 g pH 值為 ～ ， 113 ℃ 30mim 滅菌備用。 儀器和器具 亨蓋特厭氧滾管裝置一套，厭氧管，厭氧瓶，滾管機(jī)，定量加樣器。 四、實(shí)驗(yàn)流程 銅柱除氧 →預(yù)還原培養(yǎng)基 →稀釋用液制備 →稀釋樣品 →滾管 →培養(yǎng) →計數(shù) 五、實(shí)驗(yàn)方法 銅柱系統(tǒng)除氧 銅柱是一個內(nèi)部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管。此管的大小為 40—400mm，兩段被加工成漏斗裝，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來控制電壓和穩(wěn)定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端 連接氣鋼瓶，一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來的氣體如 N CO2 和 H2 等通常都含有 O2，故當(dāng)這些氣體通過溫度約 360℃的銅柱時，銅和氣體中的微量 O2 化合生成 CuO，銅柱則由明亮的黃色變?yōu)楹谏．?dāng)向氧化狀的銅柱通入 H2 時， H2 與 CuO 中的氧就結(jié)合形成 H2O，而 CuO 又被還原成了銅，銅柱則又呈現(xiàn)明亮的黃色。此銅柱可以反復(fù)使用，并不斷起到除