【正文】 第四章 細(xì)胞工程 Cell Engineering 主講教師 魏琴 教授 主要講授內(nèi)容： 1 細(xì)胞工程概述 2 植 物細(xì)胞工程 3 動(dòng)物細(xì)胞工程 4 微生物細(xì)胞工程 本章要求： ? 理解細(xì)胞工程的概念； ? 掌握植物組織培養(yǎng)的基本原理和方法； ? 理解植物非試管快繁的基本原理和方法； ? 理解植物細(xì)胞培養(yǎng)、人工種子、細(xì)胞融合的基本原理和方法； ? 了解植物細(xì)胞工程的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景； ? 理解單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞核移植與動(dòng)物克隆、染色體轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞等研究的基本原理與方法； ? 了解動(dòng)物細(xì)胞工程的研究進(jìn)展與應(yīng)用； ? 了解微生物細(xì)胞工程的基本原理； ? 了解微生物細(xì)胞工程的研究進(jìn)展與應(yīng)用。 1 細(xì)胞工程概述 作為生物工程重要分支的細(xì)胞工程，近年來獲得了令人矚目的迅速發(fā)展。這不僅是由于它在理論上具有重要的意義，而且在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面也具有廣泛的應(yīng)用前景。 細(xì)胞工程概念 ? 細(xì)胞工程：在細(xì)胞水平上研究、開發(fā)、利用各類細(xì)胞的工程，即人們根據(jù)科學(xué)設(shè)計(jì)改變細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，并通過無菌操作，大量培養(yǎng)細(xì)胞、組織乃至完整個(gè)體的技術(shù)（教材 P60）。 ? 細(xì)胞工程：應(yīng)用 細(xì)胞學(xué) 的方法，按照我們 人類的需要 和預(yù)定的設(shè)計(jì) ，有目的、有計(jì)劃地 保存 、 改變 和 創(chuàng)造新細(xì)胞及其遺傳物質(zhì) ，從而產(chǎn)生 新的種或者品種 的技術(shù)。 ? 細(xì)胞工程：應(yīng)用 細(xì)胞生物學(xué) 和 分子生物學(xué) 的方法，在 細(xì)胞水平 進(jìn)行的遺傳操作。 1 細(xì)胞工程概述 ?細(xì)胞工程 ： 是指以 細(xì)胞 為基本單位進(jìn)行 培養(yǎng)、增殖 （細(xì)胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)）或按照人們的意愿改造細(xì)胞 的某些生物學(xué)特性，從而創(chuàng)造新的生物和物種，以獲得具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物產(chǎn)品。它主要由兩部分構(gòu)成，其一是上游工程，包含細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞遺傳操作和細(xì)胞保藏三個(gè)步驟。另一個(gè)則是下游工程，是將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去，以生產(chǎn)生物產(chǎn)品的過程。 細(xì)胞工程 概念 細(xì)胞工程研究的對(duì)象 細(xì)胞或其組成部分和構(gòu)成的組織、器官等如染色體、細(xì)胞核、原生質(zhì)體、整個(gè)細(xì)胞、受精卵、胚胎、組織或器官。 1 細(xì)胞工程概述 細(xì)胞工程研究主要內(nèi)容 ? 細(xì)胞與組織培養(yǎng) ：細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)三層次 ? 細(xì)胞融合 ：單克隆抗體 ? 染色體工程 ：染色體的添加、消減、替換 ? 胚胎工程 ：胚胎分割、胚胎融合、核移植、體外受精、性別鑒定、胚胎冷凍 ? 細(xì)胞遺傳工程 ：克隆、轉(zhuǎn)基因技術(shù) 1 細(xì)胞工程概述 細(xì)胞工程的優(yōu)點(diǎn) 細(xì)胞工程開辟了基因重組的新途徑，它不需要經(jīng)過分離、提純、剪切、拼接等基因操作只需將細(xì)胞遺傳物質(zhì)直接轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，就能夠形成雜交細(xì)胞，因而提高了基因轉(zhuǎn)移的效率。 1 細(xì)胞工程概述 細(xì)胞工程克服了常規(guī)雜交的局限性，使遠(yuǎn)緣雜交有了新的途徑。它不僅可以在植物一植物之間，動(dòng)物與動(dòng)物之間，微生物與微生物之間進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，甚至可以在動(dòng)物與植物、動(dòng)物與微生物之間進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交物種。土豆 — 番茄、山綿羊、大豆 — 煙草、芹菜 — 胡蘿卜 。 用細(xì)胞工程的技術(shù)來改造和創(chuàng)造新生物，比起用基因工程技術(shù)來稍為容易些 。 細(xì)胞工程 的優(yōu)點(diǎn) 細(xì)胞工程與其他生物工程的關(guān)系 細(xì)胞工程與其他生物工程的關(guān)系 1 細(xì)胞工程概述 細(xì)胞工程的應(yīng)用 細(xì)胞工程作為科學(xué)研究的一種手段，已經(jīng)滲入到生物工程的各個(gè)方面，成為必不可少的配套技術(shù)。在農(nóng)林、園藝和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中，細(xì)胞工程正在為人類做出巨大的貢獻(xiàn)。 1 細(xì)胞工程概述 ?優(yōu)質(zhì)植物快速培育與繁殖 ?動(dòng)物胚胎工程快速繁殖優(yōu)良、瀕危品種 ?利用動(dòng)植物細(xì)胞培育生產(chǎn)活性產(chǎn)物、藥品 ?新型動(dòng)植物品種的培育 ?供醫(yī)學(xué)器官修復(fù)或移植的組織工程 ?轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的生物反應(yīng)器工程 ?珍稀動(dòng)植物資源的保存與保護(hù) ?在遺傳學(xué)發(fā)育學(xué)等領(lǐng)域的理論研究 ?在能源、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的應(yīng)用 細(xì)胞工程的應(yīng)用 2 植物細(xì)胞工程 植物組織培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng) 植物非試管快繁 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合 人工種子的研制 植物細(xì)胞工程研究進(jìn)展（綜述） 植物組織培養(yǎng) （ Plant tissue culture） 幾個(gè)重要概念 對(duì)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的要求 植物組織培養(yǎng)的步驟 主要植物組織培養(yǎng)技術(shù) 2 植物細(xì)胞工程 幾個(gè)重要概念 ? 植物細(xì)胞全能性（ Cell Totipotency） ： 指任何具有完整的細(xì)胞核的植物細(xì)胞（不管性細(xì)胞還是體細(xì)胞），都擁有形成一個(gè)完整植株所必需的全部遺傳信息，在特定的環(huán)境下能進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)立完整的個(gè)體。 滿足兩個(gè)條件 :離體 。給予適當(dāng)?shù)拇碳? 經(jīng)歷兩個(gè)過程 :脫分化 。再分化 植物組 織培養(yǎng) 脫分化 再分化 外植體 愈傷組織 生長點(diǎn) 幼莖、根 小植株 ? 植物組織培養(yǎng)： 在 無菌條件下，將離體的植物器官（根尖、莖尖、葉、花、果實(shí)、種子等）、組織（花藥、胚乳、皮層、髓組織等）、細(xì)胞（體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等）、胚胎（成熟或未成熟的胚）、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、叢生芽或長成新的完整的植株的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。由于在試管內(nèi)培養(yǎng)，且培養(yǎng)的是脫離植株母體的培養(yǎng)物，所以也叫“離體培養(yǎng)” （ Culture in vitro） 或“試管培養(yǎng)” （ In testtube culture） 。 幾個(gè)重 要概念 ?外植體 (Explant)： 植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行離體無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。 ?愈傷組織 (Callus)： 外植體產(chǎn)生的排列疏松而無規(guī)則且沒有發(fā)生分化的薄壁細(xì)胞。 ?脫分化（ dedifferentiation）： 原來已經(jīng)分化 ,并且具有一定功能的體細(xì)胞 (或性細(xì)胞 ),喪失了原有的結(jié)構(gòu)和功能 ,又重新恢復(fù)了分裂功能 ,就叫做植物細(xì)胞的脫分化。 幾個(gè)重要概念 . 2 對(duì)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的要求 ?化學(xué)實(shí)驗(yàn)室或培養(yǎng)基配制室 ?洗滌室或消煮室 ?菌室或接種室 ?培養(yǎng)室 ?觀察與鑒定室 ?溫室或苗圃 ?貯存室 接種室 培養(yǎng)室 . 2 對(duì)植物組織培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)室的要求 觀察與鑒定室 大棚 . 2 對(duì)植物組織培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)室的要求 植物組織培養(yǎng)的步驟 ( 培養(yǎng)基配制 滅菌 接種 培養(yǎng) 試管苗馴化移栽 試管苗增殖率的估算 快速繁殖工作的計(jì)劃安排 植物組 織培養(yǎng) 培養(yǎng)基（ Culture medium ）的配制 ① 一個(gè)完善的培養(yǎng)基成分： ? 無機(jī)營養(yǎng)成分 大量元素 ： 濃度大于 /升；包括 H、 O、 N、 P、 K、Ca、 Mg、 S等元素（ 配成母液 ） 微量元素 ： 其濃度小于 /升；微量元素包括 Cu、Mo、 Zn、 Na、 Mn、 Co B和 I等（ 配成母液 ） 鐵鹽 采用硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉結(jié)合成螯合鐵配置而成（ 配成母液 ） 植物組 織培養(yǎng) 的步驟 ? 有機(jī)營養(yǎng)成分 ： （ 配成母液 ） ? 碳水化合物 ： 蔗糖和葡萄糖， 白糖節(jié)約成本 一般的使用濃度為 2%— 4%。 ? 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) （常稱為激素） ： 配成母液 生長素： NAA、 IAA、 IBA、 2， 4－ D； 細(xì)胞分裂素： KT(激動(dòng)素 )、 6BA(6芐基腺嘌呤 )、 ZT（玉米素）、 2－ iP（ 2－異戊烯腺嘌呤）、 4PU、 CPPU（吡效隆）和 TDZ（噻重氮苯基脲）。 其它：赤霉素（ GA3 ）；脫落酸（ ABA）；多效唑 （ PP333 ） ? 水 ： ① 一個(gè)完善的培養(yǎng)基成分 ② 培養(yǎng)基的種類： ? 按培養(yǎng)基組成特點(diǎn)分類 ? 第一類為含鹽量高的培養(yǎng)基，如 MS、 LS、 BL、 ER。 ? 第二類為硝酸鉀含量高的培養(yǎng)基，如 B N SH。 ? 第三類是無機(jī)鹽中等含量培養(yǎng)基，如 H和 Nitsch培養(yǎng)基。 ? 第四類為低鹽含量基本培養(yǎng)基，如 White、 WS和 HE培養(yǎng)基。 ? 按培養(yǎng)基的功能分類 ? 脫分化培養(yǎng)基 初代培養(yǎng)基 ? 分化培養(yǎng)基 ? 壯苗培養(yǎng)基 ? 生根培養(yǎng)基 繼代培養(yǎng)基 ２ . 培養(yǎng)基 的配制 外植體 愈傷組織（脫分化培養(yǎng)基） 叢生芽（再分化培養(yǎng)基） 再生根（生根培養(yǎng)基） 再分化 脫分化 壯苗（壯苗培養(yǎng)基） 接種 培養(yǎng)基 的配制 ③ 怎樣選取最佳培養(yǎng)基方案 （例： MS++NAA1mg/L+Su3%+%） 對(duì)于某個(gè)待培養(yǎng)的目的植物來講： 查資料 預(yù)備性試驗(yàn) 觀察培養(yǎng)物的反映 調(diào)整：單因子試驗(yàn)，多因子試驗(yàn)和 正交設(shè)計(jì) 逐步添加和逐步排除 ? 基本培養(yǎng)基的選擇 ? 激素的選擇：激素種類、濃度、激素配比 ? 糖的選擇：糖的種類、濃度的選擇 ? 瓊脂的選擇：主要是濃度的選擇 ? 附加物的選擇：香蕉汁、活性炭、椰子汁等 濃度為 mg/L 細(xì)胞分裂素 3 生 長 素 0 （ 1） （ 2） （ 3） （ 4） （ 5） （ 6） （ 7） （ 8） （ 9） （ 10） （ 11） （ 12） （ 13） （ 14）