細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件(已修改)
2025-01-29 20:59 本頁(yè)面
【正文】 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 劉湘帆 講師 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) ? 從生物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外(in vitro)模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，對(duì)這些組織或細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之保持一定的結(jié)構(gòu)和功能，以便于我們觀察研究，這種方法就是細(xì)胞培養(yǎng)（ cell culture）。有時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)也稱為組織培養(yǎng)（ tissue culture），二者可作為同義語(yǔ)使用。 ? 細(xì)胞培養(yǎng)的工作始于 20世紀(jì)初目前廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，并且是各種細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。哈里森（ Harrison， 1907），因此被稱為“ 組織培養(yǎng)之父 ” 一、基礎(chǔ)理論 ? （一）培養(yǎng)細(xì)胞的類型及其特點(diǎn) ? 體外培養(yǎng)細(xì)胞大多培養(yǎng)在瓶皿等容器中，根據(jù)它們是否能貼附在支持物上生長(zhǎng)的特性，可分為貼附型和懸浮型兩大類。 （ 1）貼附型 ? 大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞均為貼附型，它們必須貼附在支持物表面生長(zhǎng)，這類細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)各自具有其特殊的形態(tài)，但在體外培養(yǎng)時(shí)貼附于支持物后形態(tài)上表現(xiàn)單一化而失去體內(nèi)原有的某些特征，多呈上皮樣或成纖維細(xì)胞樣。 培養(yǎng)細(xì)胞的類型及其特點(diǎn) ? 貼附細(xì)胞型 MRC5成纖維細(xì)胞 培養(yǎng)細(xì)胞的類型及其特點(diǎn) ? 貼附型細(xì)胞正常猴腎單層上皮細(xì)胞 正常貼附型細(xì)胞的特點(diǎn) ? 接觸抑制： 正常貼附型細(xì)胞具有接觸抑制的特性，細(xì)胞相互接觸后可抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，因此細(xì)胞不會(huì)相互重疊于其上面生長(zhǎng)。 ? 密度抑制： 細(xì)胞生長(zhǎng)、匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充分，仍可增殖分裂，但當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定密度后，由于營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，細(xì)胞分裂停止，稱為密度抑制。 ?腫瘤細(xì)胞的接觸抑制及密度抑制往往減弱或消失，因此細(xì)胞可向三維空間發(fā)展，導(dǎo)致細(xì)胞堆積，并可生長(zhǎng)至較高的終末細(xì)胞密度。 (2) 懸浮型 ? 少數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不貼附于支持物上，而以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，包括一些取自血、脾或骨髓的培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是血液白細(xì)胞，以及一些腫瘤細(xì)胞。 ? 細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)時(shí)可以呈單個(gè)細(xì)胞或細(xì)小的細(xì)胞團(tuán)，胞體為圓形。 ? 其優(yōu)點(diǎn)是在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，生存空間大，允許長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)，便于大量繁殖。 （二）培養(yǎng)細(xì)胞的增殖過(guò)程 ? 培養(yǎng)細(xì)胞的生命期 ? 培養(yǎng)細(xì)胞的生命期（ life span）指的是細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間，一般可分為原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。從體內(nèi)取出細(xì)胞接種培養(yǎng)到第一次傳代叫原代培養(yǎng)，一般持續(xù) 14周。 ? 原代細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱為細(xì)胞系（ cell line），進(jìn)入傳代期，此期在全生命期中持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體的核型。一般情況下可傳代 1050次，隨后細(xì)胞增殖緩慢以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入衰退期，最后死亡。 ? 腫瘤細(xì)胞系可無(wú)限增殖而無(wú)衰退期，正常細(xì)胞系也可在傳代期末期或衰退期發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞獲得永生性即永久增殖的能力，稱為無(wú)限細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系。 培養(yǎng)細(xì)胞一代的增殖過(guò)程 ? 培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間相對(duì)孤立，營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖至一定密度后，則需分離出一部分細(xì)胞接種到其他容器，并及時(shí)更新培養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過(guò)程叫 傳代 （ passage 或 subculture）。 ? 從細(xì)胞接種到下一次傳代再培養(yǎng)的一段時(shí)間叫一代。需要注意的是細(xì)胞培養(yǎng)一代與細(xì)胞倍增（ doubling）的概念是不同的，細(xì)胞倍增指的是細(xì)胞數(shù)增加一倍。一般地，細(xì)胞培養(yǎng)一代的過(guò)程中，細(xì)胞可倍增 26次。 ? 細(xì)胞傳一代以后，細(xì)胞群體一般要經(jīng)過(guò)潛伏期、指數(shù)增長(zhǎng)期與平臺(tái)期三個(gè)階段。 ? 以貼附型細(xì)胞為例說(shuō)明如下：細(xì)胞接種后呈懸浮狀態(tài)，在 0． 54 h內(nèi)貼附于支持物，進(jìn)入潛伏期，此期細(xì)胞無(wú)增殖發(fā)生，原代細(xì)胞持續(xù)約 2496 h，而腫瘤細(xì)胞或無(wú)限傳代細(xì)胞僅需 624 h。 ? 隨著分裂相細(xì)胞的出現(xiàn)并逐漸增多，細(xì)胞群體進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，此期又稱對(duì)數(shù)期，細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最佳， 適于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究 ；此期時(shí)間長(zhǎng)短因細(xì)胞本身特性及接種密度、 血清濃度而不完全相同，一般可持續(xù) 35天。 ? 隨著細(xì)胞數(shù)量的逐漸增多，細(xì)胞相互接觸匯合成片，因接觸抑制及密度抑制細(xì)胞停止分裂繁殖，進(jìn)入 平臺(tái)期 ，細(xì)胞數(shù)目不再增加，但仍維持一定時(shí)間的活力，此時(shí)應(yīng) 及時(shí) 分離傳代，否則細(xì)胞將因中毒而發(fā)生改變甚至死亡。懸浮型細(xì)胞一般沒(méi)有潛伏期，接種并添加新鮮培養(yǎng)液后即可迅速進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期。 3. 培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件 ? 培養(yǎng)細(xì)胞需要特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)設(shè)備。培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)，浸浴于 培養(yǎng)液 ，并需要特有的 環(huán)境 ，包括一定的 溫度、濕度和氣體成分。 培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件 培養(yǎng)皿 或培養(yǎng)瓶 溫度、濕度和氣體由 CO2恒溫孵育箱提供 生長(zhǎng) 培養(yǎng)液 10％～ 20％ 的血清 維持 培養(yǎng)液 2％～ 5％ 的血清 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 糖、氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)離子、微量元素等 （ 1）培養(yǎng)基 ? 培養(yǎng)細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)細(xì)胞相同，包括糖、氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)離子、微量元素等。細(xì)胞在體外生存于含各種營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中。 ? 來(lái)自于動(dòng)物體液和分離組織提取的天然培養(yǎng)基有血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等，但制作過(guò)程復(fù)雜，批間差異大，已逐漸被 合成培養(yǎng)基 取代。 培養(yǎng)基的種類 ? 按其物質(zhì)狀態(tài)，分半固體培養(yǎng)基（如軟瓊脂培養(yǎng)基）和液體培養(yǎng)基兩類，其中液體培養(yǎng)基（即培養(yǎng)液）使用最為廣泛。目前市場(chǎng)上有多種配制好的細(xì)胞培養(yǎng)液出售，但價(jià)格較昂貴。實(shí)際工作中多用市售培
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