【正文】 課程名稱 ： 醫(yī) 學(xué) 微 生 物 學(xué) 教學(xué)內(nèi)容 ： 細(xì)菌感染的檢查 方法及防治原則 學(xué) 時： 學(xué)時 教學(xué)目的 ： 掌握 臨床細(xì)菌標(biāo)本的采集、送檢原則 ,革蘭染色法的步驟 熟悉 病原菌的檢驗程序、常用血清學(xué)試驗的原理 了解 細(xì)菌學(xué)檢查在臨床診斷中的重要性 教學(xué)方法 ：理 論 教學(xué)重點、難點、關(guān)鍵 ： 病原菌的檢驗程序 細(xì)菌學(xué)診斷 (bacteriological diagnosis) 示蹤性檢測 ? 形態(tài)學(xué)檢查 ? 分離培養(yǎng) ? 生化試驗 ? 血清學(xué)鑒定 致病力和藥敏測定 ? 動物實驗 ? 毒力檢測 ? 藥物敏感試驗 病原微生物感染的檢查法 臨床細(xì)菌標(biāo)本的采集、送檢原則 :避免人為污染 :根據(jù)疾病種類和病程不同 , 采集不同標(biāo)本 (specimens) 如 : 傷寒 第一周 取血 第二、三周 取大、小便、骨髓 (1)疾病早期 (2)使用抗菌藥物之前 ,如已用抗生素 ,應(yīng)停 用 1— 2天 (3)機體免疫因素形成之前 (4)未出現(xiàn)合并或繼發(fā)感染之前 4. 快速送檢 : 大多數(shù)細(xì)菌低溫送檢 ,但奈瑟球菌須 3040℃ 保溫送檢 標(biāo)本采集的準(zhǔn)確性是檢查結(jié)果可靠性的保證 1 、 直接涂片鏡檢 ?形態(tài)與染色性具有特征的病原菌可直接染色鏡檢，根據(jù)典型形態(tài)、排列、染色性做初步診斷 (一 ) 、 病原菌分離鑒定的一般程序： 一、形態(tài)學(xué)檢查 (1)不染色標(biāo)本的檢查 主要用于觀察病原菌的某些形態(tài)特點 及運動性 ?常用的方法有壓滴法和懸滴法 如 :用壓滴法觀察霍亂弧菌的“ 魚群樣運動 ” ?暗視野檢查 ?用于檢查活菌、螺旋體及其動力 (2)染色標(biāo)本的檢查 染色 單染 復(fù)染 正染 負(fù)染 (negative staining) 革蘭染色法 抗酸染色法 熒光染色 單染色 :只用一種染料進(jìn)行染色 . 可分為 : 正染 :標(biāo)本著色 ,背景不著色 負(fù)染 :標(biāo)本不著色 ,背景著色 用于形態(tài)的觀察 ,不能鑒別染色性 復(fù)染色 :用兩種或兩種以上的染料進(jìn)行 染色 目前常用的有 :革蘭染色法、抗酸染 色法、熒光染色、特殊 染色法 既可觀察形態(tài)結(jié)構(gòu) ,又可鑒別染色性 革蘭染色法步驟 : 制片 : 涂片 染色 : 結(jié)晶紫初染 1分鐘 水沖洗 碘液媒染 1分鐘 水沖洗 95%乙醇脫色 30秒左右 水沖洗 稀釋復(fù)紅復(fù)染 30秒 水沖洗 干后油鏡下觀察 干燥 固定 涂 片 干 燥 固 定 染 色 鏡 檢 結(jié)果 : 染成 紫色 稱革蘭染色陽性 G+ 染成 紅色 稱革蘭染色陰性 G 原理 : (1)等電點學(xué)說 結(jié)晶紫為堿性染料 (2)化學(xué)學(xué)說 G+含有核糖核酸鎂鹽 ,能與結(jié)晶紫形成牢固的復(fù)合物 (3)通透性學(xué)說 G+ G P I 2～ 3 4～ 6 核糖核酸鎂鹽 + 通透性 小 大 脂質(zhì) 少 多 意義 : (1)鑒別細(xì)菌 (2)指導(dǎo)臨床用藥 (3)了解細(xì)菌的致病性 二 、 分離培養(yǎng) → 純培養(yǎng)： 根據(jù)不同標(biāo)本采取不同培養(yǎng)基。 分離化膿性球菌如鏈球菌、肺炎球菌可采用血平板；分離腦膜炎球菌可采用巧克力平板 菌落形態(tài)觀察 : 大小、表面、透明度、邊緣、高度、色素、溶血等 三 、 生化反應(yīng)： 通過檢測細(xì)菌代謝產(chǎn)物的生化反應(yīng)鑒定細(xì)菌的種類 乳糖發(fā)酵試驗、甲基紅試驗、硫化氫試驗等。 四 、 血清學(xué)鑒定 : (serological identification)： 用已知抗體檢測標(biāo)本中分離得到的病原菌的血清型別，采用玻片凝集法。 原理： 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的 MIC呈負(fù)相關(guān)。 紙片擴散法 （ KirbyBauer法） 五 、 藥敏試驗： 抑菌圈 或抑菌環(huán) 紙片擴散法 原理： 聚乙烯板內(nèi)含有各種稀釋度的抗菌藥物，實驗時 加入 100μ l濃度為 105 CFU/ml的菌液，蓋上蓋板， 35℃ 16～ 20h觀察結(jié)果。孔底部清晰不出現(xiàn)細(xì)菌沉淀的最低 抗菌藥物濃度即為該抗菌藥物對細(xì)菌的最小抑菌濃度， 通過 CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感和耐藥。再取 環(huán)取肉眼觀察無菌生長的液體接種于血瓊脂平板作次代 培養(yǎng)，經(jīng) 35℃ 過夜培養(yǎng)后觀察最低抗菌藥物濃度能殺死 ％原始種入的細(xì)菌即為該菌的最低殺菌濃度 (MBC)。 微量液體稀釋法 (microdilution test) 用微量加樣器接種 100μ l 到 96孔中，蓋上蓋板。 同時作陽性、陰性對照。 手工看濁度或儀器自動 判讀。按照 CLSI標(biāo)準(zhǔn)報 告細(xì)菌對某抗菌藥物為 敏感、耐藥和中介。 原理： E試條是一條 5mm 50mm無孔試劑載體，一面 固定有一系列預(yù)先制備的濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗 菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別的刻度?？咕幬锏奶? 度可覆蓋有 20個 MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍。將 E 試條放在細(xì)菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍 繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點 的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的最小抑菌濃度， 對照 CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感、耐藥、中介。 ETEST 孵育后形成一橢圓形抑菌圈，抑菌圈和試條的相交 處的刻度即為抗菌藥物對該菌的最低抑菌濃度 (MIC) 。 六、細(xì)菌成分的檢測 (detection of bacterial antigens)： 目前應(yīng)用最為廣泛的是細(xì)菌抗原的檢測 如 : 協(xié)同凝集試驗、間接凝集試驗、 熒光抗體法、酶免疫法、核酸雜交、 聚合酶鏈反應(yīng)等 七、檢測細(xì)菌相應(yīng)抗體 均為免疫學(xué)方法 經(jīng)典方法如 : 凝集試驗、沉淀反應(yīng)、補體結(jié)合試驗 現(xiàn)代快速方法主要是免疫標(biāo)記技術(shù) 通常采用取雙份血清，其間間隔 1～ 2周。后一份血清抗體效價比前一份升高 4倍以上有診斷意義。 細(xì)菌感染的實驗診斷 病原微生物感染的防治原則 微生物感染所導(dǎo)致的感染性疾病 的控制由預(yù)防和治療兩方面組成 預(yù)防 :對病原微生物傳播的各個環(huán)節(jié)進(jìn)