【正文】 課程名稱 ： 醫(yī) 學(xué) 微 生 物 學(xué) 教學(xué)內(nèi)容 ： 細(xì)菌感染的檢查 方法及防治原則 學(xué) 時(shí)： 學(xué)時(shí) 教學(xué)目的 ： 掌握 臨床細(xì)菌標(biāo)本的采集、送檢原則 ,革蘭染色法的步驟 熟悉 病原菌的檢驗(yàn)程序、常用血清學(xué)試驗(yàn)的原理 了解 細(xì)菌學(xué)檢查在臨床診斷中的重要性 教學(xué)方法 ：理 論 教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)、關(guān)鍵 ： 病原菌的檢驗(yàn)程序 細(xì)菌學(xué)診斷 (bacteriological diagnosis) 示蹤性檢測(cè) ? 形態(tài)學(xué)檢查 ? 分離培養(yǎng) ? 生化試驗(yàn) ? 血清學(xué)鑒定 致病力和藥敏測(cè)定 ? 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) ? 毒力檢測(cè) ? 藥物敏感試驗(yàn) 病原微生物感染的檢查法 臨床細(xì)菌標(biāo)本的采集、送檢原則 :避免人為污染 :根據(jù)疾病種類和病程不同 , 采集不同標(biāo)本 (specimens) 如 : 傷寒 第一周 取血 第二、三周 取大、小便、骨髓 (1)疾病早期 (2)使用抗菌藥物之前 ,如已用抗生素 ,應(yīng)停 用 1— 2天 (3)機(jī)體免疫因素形成之前 (4)未出現(xiàn)合并或繼發(fā)感染之前 4. 快速送檢 : 大多數(shù)細(xì)菌低溫送檢 ,但奈瑟球菌須 3040℃ 保溫送檢 標(biāo)本采集的準(zhǔn)確性是檢查結(jié)果可靠性的保證 1 、 直接涂片鏡檢 ?形態(tài)與染色性具有特征的病原菌可直接染色鏡檢，根據(jù)典型形態(tài)、排列、染色性做初步診斷 (一 ) 、 病原菌分離鑒定的一般程序： 一、形態(tài)學(xué)檢查 (1)不染色標(biāo)本的檢查 主要用于觀察病原菌的某些形態(tài)特點(diǎn) 及運(yùn)動(dòng)性 ?常用的方法有壓滴法和懸滴法 如 :用壓滴法觀察霍亂弧菌的“ 魚群樣運(yùn)動(dòng) ” ?暗視野檢查 ?用于檢查活菌、螺旋體及其動(dòng)力 (2)染色標(biāo)本的檢查 染色 單染 復(fù)染 正染 負(fù)染 (negative staining) 革蘭染色法 抗酸染色法 熒光染色 單染色 :只用一種染料進(jìn)行染色 . 可分為 : 正染 :標(biāo)本著色 ,背景不著色 負(fù)染 :標(biāo)本不著色 ,背景著色 用于形態(tài)的觀察 ,不能鑒別染色性 復(fù)染色 :用兩種或兩種以上的染料進(jìn)行 染色 目前常用的有 :革蘭染色法、抗酸染 色法、熒光染色、特殊 染色法 既可觀察形態(tài)結(jié)構(gòu) ,又可鑒別染色性 革蘭染色法步驟 : 制片 : 涂片 染色 : 結(jié)晶紫初染 1分鐘 水沖洗 碘液媒染 1分鐘 水沖洗 95%乙醇脫色 30秒左右 水沖洗 稀釋復(fù)紅復(fù)染 30秒 水沖洗 干后油鏡下觀察 干燥 固定 涂 片 干 燥 固 定 染 色 鏡 檢 結(jié)果 : 染成 紫色 稱革蘭染色陽性 G+ 染成 紅色 稱革蘭染色陰性 G 原理 : (1)等電點(diǎn)學(xué)說 結(jié)晶紫為堿性染料 (2)化學(xué)學(xué)說 G+含有核糖核酸鎂鹽 ,能與結(jié)晶紫形成牢固的復(fù)合物 (3)通透性學(xué)說 G+ G P I 2～ 3 4～ 6 核糖核酸鎂鹽 + 通透性 小 大 脂質(zhì) 少 多 意義 : (1)鑒別細(xì)菌 (2)指導(dǎo)臨床用藥 (3)了解細(xì)菌的致病性 二 、 分離培養(yǎng) → 純培養(yǎng)： 根據(jù)不同標(biāo)本采取不同培養(yǎng)基。 分離化膿性球菌如鏈球菌、肺炎球菌可采用血平板；分離腦膜炎球菌可采用巧克力平板 菌落形態(tài)觀察 : 大小、表面、透明度、邊緣、高度、色素、溶血等 三 、 生化反應(yīng)： 通過檢測(cè)細(xì)菌代謝產(chǎn)物的生化反應(yīng)鑒定細(xì)菌的種類 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)等。 四 、 血清學(xué)鑒定 : (serological identification)： 用已知抗體檢測(cè)標(biāo)本中分離得到的病原菌的血清型別，采用玻片凝集法。 原理： 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成無菌生長(zhǎng)的透明圈即為抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的 MIC呈負(fù)相關(guān)。 紙片擴(kuò)散法 （ KirbyBauer法） 五 、 藥敏試驗(yàn)： 抑菌圈 或抑菌環(huán) 紙片擴(kuò)散法 原理： 聚乙烯板內(nèi)含有各種稀釋度的抗菌藥物，實(shí)驗(yàn)時(shí) 加入 100μ l濃度為 105 CFU/ml的菌液，蓋上蓋板， 35℃ 16～ 20h觀察結(jié)果?？椎撞壳逦怀霈F(xiàn)細(xì)菌沉淀的最低 抗菌藥物濃度即為該抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度， 通過 CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感和耐藥。再取 環(huán)取肉眼觀察無菌生長(zhǎng)的液體接種于血瓊脂平板作次代 培養(yǎng)，經(jīng) 35℃ 過夜培養(yǎng)后觀察最低抗菌藥物濃度能殺死 ％原始種入的細(xì)菌即為該菌的最低殺菌濃度 (MBC)。 微量液體稀釋法 (microdilution test) 用微量加樣器接種 100μ l 到 96孔中，蓋上蓋板。 同時(shí)作陽性、陰性對(duì)照。 手工看濁度或儀器自動(dòng) 判讀。按照 CLSI標(biāo)準(zhǔn)報(bào) 告細(xì)菌對(duì)某抗菌藥物為 敏感、耐藥和中介。 原理： E試條是一條 5mm 50mm無孔試劑載體，一面 固定有一系列預(yù)先制備的濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋抗 菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別的刻度?？咕幬锏奶? 度可覆蓋有 20個(gè) MIC對(duì)倍稀釋濃度的寬度范圍。將 E 試條放在細(xì)菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍 繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn) 的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的最小抑菌濃度， 對(duì)照 CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感、耐藥、中介。 ETEST 孵育后形成一橢圓形抑菌圈，抑菌圈和試條的相交 處的刻度即為抗菌藥物對(duì)該菌的最低抑菌濃度 (MIC) 。 六、細(xì)菌成分的檢測(cè) (detection of bacterial antigens)： 目前應(yīng)用最為廣泛的是細(xì)菌抗原的檢測(cè) 如 : 協(xié)同凝集試驗(yàn)、間接凝集試驗(yàn)、 熒光抗體法、酶免疫法、核酸雜交、 聚合酶鏈反應(yīng)等 七、檢測(cè)細(xì)菌相應(yīng)抗體 均為免疫學(xué)方法 經(jīng)典方法如 : 凝集試驗(yàn)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 現(xiàn)代快速方法主要是免疫標(biāo)記技術(shù) 通常采用取雙份血清，其間間隔 1～ 2周。后一份血清抗體效價(jià)比前一份升高 4倍以上有診斷意義。 細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)診斷 病原微生物感染的防治原則 微生物感染所導(dǎo)致的感染性疾病 的控制由預(yù)防和治療兩方面組成 預(yù)防 :對(duì)病原微生物傳播的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)