分子生物學(xué)研究法上(已修改)
2025-01-25 07:59 本頁(yè)面
【正文】 第五章 分子生物學(xué)基本研究法（上） —— DNA、 RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù) 現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展 ， 得益于上個(gè)世紀(jì)中葉以來研究方法 、 特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步 。 基因操作主要包括 DNA分子的切割與連接 、 雜交 、 電泳 、 細(xì)胞轉(zhuǎn)化 、 核酸序列分析以及基因人工合成 、 表達(dá) 、 定點(diǎn)突變和 PCR擴(kuò)增 等 ， 是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù) 。 基因工程 是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。 基因工程技術(shù) 是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。 事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 （ 三大成就 ） ： 一 、 在 20世紀(jì) 40年代確定了遺傳信息的攜帶者 （ 即基因的分子載體是 DNA而不是蛋白質(zhì) ， 解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題 ） ； 二、 50年代提出了 DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制 ,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題； 三、 50年代末至 60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說 ,成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動(dòng)與表達(dá)機(jī)制。 基因操作的基本工具 DNA操作技術(shù) RNA基本操作技術(shù) SNP的理論與應(yīng)用 基因克?。?clone）技術(shù) 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) （ 一 ） 限制性核酸內(nèi)切酶 能夠識(shí)別 DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開 DNA分子 。 第一個(gè)核酸內(nèi)切酶 EcoRI是 Boyer實(shí)驗(yàn)室在 1972年發(fā)現(xiàn)的 ，它能特異性識(shí)別 GAATTC序列 ， 將雙鏈 DNA分子在這個(gè)位點(diǎn)切開并產(chǎn)生具有 粘性末端 （ 不是整齊地切開 ， 即在兩條鏈上的切開位點(diǎn)不對(duì)稱 ） 的小片段 。 基因操作的基本工具 圖 51 幾種主要 DNA內(nèi)切酶所識(shí)別的序列及其酶切位點(diǎn) （二）基因克隆的載體 基因克隆 即重組 DNA技術(shù) ,指在體外對(duì) DNA分子按照既定的目的和方案 ,采用酶學(xué)方法將不同來源的 DNA分子在體外剪切和重新連接 ,組裝成一個(gè)新的 DNA分子。在此基礎(chǔ)上 ,將這個(gè) DNA分子導(dǎo)入到一定的宿主細(xì)胞 ,使它能夠在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增 ,形成大量的子代分子 ,此過程即稱為基因克隆 .基因克隆包括四個(gè)基本技術(shù)環(huán)節(jié) : 目的基因和載體的獲得 。 目的基因與載體連接 ,形成重組分子 。 重組 DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞 。 含有重組 DNA分子的細(xì)胞的篩選和擴(kuò)增； 基因克隆又稱為 DNA重組技術(shù) ,DNA克隆或分子克隆。 基因克隆載體的三要素： ? 自我復(fù)制能力； ? 攜帶外源基因片段大小； ? 插入位點(diǎn)多少； 易于鑒定識(shí)別程度。 大腸桿菌質(zhì)粒載體 : pSC101質(zhì)粒載體 ? 低拷貝數(shù)嚴(yán)緊型復(fù)制控制的大腸桿菌質(zhì)粒載體 ， 平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有 1~2個(gè)拷貝 。 ? 長(zhǎng) ， 帶有四環(huán)素抗性基因（ tetr ） 及 EcoRI 、 HindIII 、BamHI、 SalI、 XhoI、 PvuII以及 SmaI等 7種限制性核酸內(nèi)切酶的 單 酶 切 位 點(diǎn) ， 在 HindIII 、BamHI和 SalI等 3個(gè)位點(diǎn)插入外源基因 ， 會(huì)導(dǎo)致 tetr失活 。 大腸桿菌 pSC101質(zhì)粒載體示意圖 。 是第一個(gè)真核基因克隆載體 。 缺點(diǎn)： 它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制 （ 在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制除了受本身的復(fù)制機(jī)構(gòu)的控制外 ， 還受染色體的嚴(yán)緊控制 ， 因此拷貝數(shù)較少 ， 一般只有 1— 2個(gè) /每染色體 。 ） 的低拷貝質(zhì)粒 ， 從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取 pSC101 DNA， 產(chǎn)量很低 。 ColE1質(zhì)粒載體 ? 松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒 。 ? 一般情況下 ， 當(dāng)培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡 ， 或是在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成 ， 寄主染色體 DNA的復(fù)制便被抑制 ，細(xì)胞的生長(zhǎng)也隨之停止 。 ? 而松弛型質(zhì)粒 DNA卻繼續(xù)復(fù)制數(shù)小時(shí) ， 使每個(gè)寄主細(xì)胞中 ColE1 質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到1000~3000個(gè) ， 占細(xì)胞總 DNA的 50%左右 。 穿梭質(zhì)粒載體 （ shuttle plasmid vector） 指由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào) ， 可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體 。 由于這類質(zhì)粒載體可以保證外源 DNA序列在不同物種的細(xì)胞之間得到擴(kuò)增 ， 能在原核和真核細(xì)胞之間往返穿梭 ，具有廣泛的用途 。 5. 2. 1 核酸的凝膠電泳 自從瓊脂糖 （ agarose ） 和聚丙烯酰胺（ polyacrylamide） 凝膠被引入核酸研究以來 ，按分子量大小分離 DNA的凝膠電泳技術(shù) ， 已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組 DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段 。 DNA操作技術(shù) 一種分子被放置到電場(chǎng)中 ， 它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O 。 我們把這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度 ， 叫做電泳的 遷移率 ， 它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比 ， 與片段大小成反比 。 生理?xiàng)l件下 ， 核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài) ， 所以 ， DNA和 RNA又被稱為多聚陰離子 （ polyanions） ， 在電場(chǎng)中 向正電極的方向遷移 。 由于糖 磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì) ， 相同數(shù)量的雙鏈 DNA幾乎具有等量的凈電荷 ， 因此它們能 以同樣的速度向正電極方向遷移 。 瓊脂糖凝膠分辨 DNA片段的范圍為 ~50kb之間。 聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為 1到 1000個(gè)堿基對(duì)之間。 凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。 瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨 DNA片段的能力 凝膠類型及濃度 分離 DNA的大小范圍（ bp） %瓊脂糖 50 000~1 000 %瓊脂糖 20 000~1 000 %瓊脂糖 6 000~300 %聚丙烯酰胺 1 000~100 %聚丙烯酰胺 500~25 %聚丙烯酰胺 50~1 溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì) DNA分子的插入作用 。 由于插入了溴化乙錠分子 ， 在紫外光照射下 ， 瓊脂糖凝膠電泳中 DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光 ， 易于鑒定 。 （ 溴化乙錠
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