【正文】 1 酶工程 Enzyme Engineering 曹新志 Email: TEL:13890062236 2 主要參考書 ?? 郭勇 主編，酶工程。北京：中國輕工業(yè)出 ? 版社， 2022 ?? 羅貴民 主編，酶工程。北京：化學(xué)工業(yè)出 ? 版社， 2022 ?? 陳石根 ，周潤琦編著，酶學(xué)。上海：復(fù)旦 ? 大學(xué)出版社， 2022 ?? 郭勇 ，鄭穗平編著，酶學(xué)。廣州：華南理 ? 工大學(xué)出版社， 2022 3 現(xiàn)代生物工程： ?（ gene engineering） ?（ cell engineering） ?（ enzyme engineering） ?（ fermentation engineering） ?（ protein engineering ） 4 ??? 緒論 ??? 酶的工業(yè)生產(chǎn) ??? 酶的分離純化與制劑 ??? 固定化酶和固定化細(xì)胞 ? 酶反應(yīng)器 ??? 酶的非水相催化 ??? 酶制劑的應(yīng)用 5 第一章 緒論 (ENZYME ENGINEERING) 酶工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分。 其 特點 是 利用酶、含酶細(xì)胞器或細(xì)胞 (微生物、植物、動物 )作為生物催化劑來完成某些重要的化學(xué)反應(yīng) 。 1 6 ?第一節(jié) 酶工程概述 ?第二節(jié) 酶的分類、組成、結(jié)構(gòu)特點和作用機(jī)制 ?第三節(jié) 酶作為催化劑的顯著特點 ?第四節(jié) 影響酶活力的因素 ?第五節(jié) 酶動力學(xué)和抑制作用 7 生物技術(shù) 的 四大支柱 基因工程 細(xì)胞工程 酶工程 發(fā)酵工程生物技術(shù)（ 生物工程 ）8 基因工程 ： 用 “ 剪刀 +糨糊 ” 創(chuàng)造新物種的工程。 細(xì)胞工程 ： 微觀水平的嫁接技術(shù)。 酶工程： 讓工廠高效、安靜、美麗如畫的工程。 發(fā)酵工程： 把微生物或細(xì)胞造就成無數(shù)微型工 廠，將神話變?yōu)楝F(xiàn)實的橋梁。 9 第一節(jié) 酶工程概述 一、 酶與酶工程發(fā)展簡史 （一）酶學(xué)研究簡史 1. 不自覺的應(yīng)用：釀酒、造醬、制飴糖、治病 2. 酶學(xué)的產(chǎn)生 : 消化與發(fā)酵現(xiàn)象 10 （ 1）消化 ?法國著名科學(xué)家雷默（ 16831757）認(rèn)為消化是一個在胃液作用的化學(xué)過程而不僅僅是一個物理過程。 ?1777年，意大利物理學(xué)家 Spallanzani(斯帕蘭扎尼 ) 的山鷹實驗。證明在胃液中存在一些特殊的活性成分 ?1822年，美國外科醫(yī)生 Beaumont 研究食物 在胃里的消化。 ?19世紀(jì) 30年代，德國科學(xué)家施旺獲得胃蛋白酶 。 11 （ 2）發(fā)酵 ?1684年，比利時醫(yī)生 Helment提出 ferment— 引起釀酒過程中物質(zhì)變化的因素（酵素）。 ?1833年，法國化學(xué)家 Payen (佩恩 )和 Person(帕索茲 ) 用酒精處理麥芽抽提液，得到淀粉酶（ diastase）。 ?1878年，德國科學(xué)家 K?hne(庫尼 )提出 enzyme— 從活生物體中分離得到的酶，意思是 “ 在酵母中 ” （希臘文）。 12 小插曲 19世紀(jì)， Pasteur和 Liebig學(xué)術(shù)長期爭論 : 1857年，法國化學(xué)家和微生物學(xué)家 Pasteur(巴斯德 )認(rèn)為沒有生物則沒有發(fā)酵。 德國化學(xué)家 Liebig認(rèn)為發(fā)酵是由化學(xué)物質(zhì)引起的。 此爭議由德國學(xué)者 Buchner(巴克鈉 )兄弟于 1896年解決 。 13 Buchner兄弟的試驗： 用細(xì)砂研磨酵母細(xì)胞，壓取汁液，汁液不含活細(xì)胞，但仍能使糖發(fā)酵生成酒精和二氧化碳。 證明：發(fā)酵與細(xì)胞的活動無關(guān)。 14 T he No bel Pr ize in Chem is tr y 1 90 7 f or h is b ioc he mi ca l re se a rc he s a n d hi s di scov e ry of c e l l f re e f e rm e nt a t ionb . 1860d . 1917Land w i r t sc h af t l i ch eHo chs chu l e (A g r i c u l tu r a l Coll e g e ) B e r l i n , G e r man y G e r man y E du a r d Bu c h n er15 酶 —— 活細(xì)胞產(chǎn)生的，能在細(xì)胞內(nèi)外起作用的（催化）生理活性物質(zhì) 。 enzyme— anic chemical substance (a catalyst) formed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself. 酶的化學(xué)本質(zhì)？ 16 （理論研究） （ 1） 酶的化學(xué)本質(zhì) ?德國化學(xué)家 。 ?1926年 ,美國康乃爾大學(xué)的 “ 獨臂學(xué)者 ” Sumner（薩姆納）博士從刀豆中提取出脲酶結(jié)晶，并證明具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)。 并獲得 1947年的諾貝爾獎 。 ?1930年，美國的生物化學(xué)家 Northrop分離得到了胃蛋白酶（ pepsin）、胰蛋白酶（ trypsin）、胰凝乳蛋白酶（ chymotrypsin）結(jié)晶，確立了酶的化學(xué)本質(zhì)。 17 T he No bel Pr ize in Chem is tr y 1 94 6 fo r th eir p re p ar ati o n o f en z y m es an dv i ru s p ro tei n s in a p u r e f o rm― fo r h i s disco ve r y th at en z y me s ca n b e cr y st all i z ed 1 9 0 4 1 9 7 11 8 9 1 1 9 8 71 8 8 7 1 9 5 5R o ckef e l l e r In stitu te f o r M e dica l R e sea rc h Prin c e to n , NJ , US A R o ckef e l l e r In stitu te f o r M e dica l R e sea rc h Prin c e to n , NJ , US A C o rnel l Un iv e rsity It haca , NY , US A1 / 4 o f th e priz e 1 / 4 o f th e priz e 1 / 2 o f th e priz e Wend el l M er ed i t h S t a n l eyJohn H o wa r d N o r t hr o pJa m es B a t chel l erS um ner18 U re a se crys ta ls ( X 7 28 )S u mne r, J. B. ( 1 9 2 6 ) ― T h e is ola ti on a nd c r ys ta ll izat ion of th e en zy me urea se ‖ J. Bio l. C h em. 6 9 : 4 3 5 4 4 1 .19 P ep s in c r ys ta l s(X 9 0 )N orth rop, 1 9 3 0 )N or t h r op , J. H. (1 9 30)― C rys t a ll in p e p s in, 1 : Is ola t i on a n d t es t s of p u ri t y ‖ J. G en . Ph ys iol .1 3 :7 39 7 66 .20 21 22 （ 2） 酶學(xué)理論研究 1890年， Fisher—— 鎖鑰學(xué)說。 1902年， Henri—— 中間產(chǎn)物學(xué)說。 1913年， Michaelis 和 Menten—— 米氏學(xué)說。 1958年， Koshland—— 誘導(dǎo)契合學(xué)說。 1960年， Jacob 和 Monod—— 操縱子學(xué)說。 23 Characteristics of enzyme active sites Lock and key model (鎖鑰 ) 1890 picture by Emil fisher. This model assumed that only a substrate of the proper shape could fit with the enzyme. Induced –fit model (誘導(dǎo)契合 ) proposed by Daniel Koshland in 1958. This model assumes continuous changes in active site structure as a substrate binds. 24 25 中間產(chǎn)物學(xué)說 ES P S E 26 Steps in an enzymatic reaction 1. Enzyme and substrate bine to form a Complex. 2. Complex goes through a transition state not quite substrate or product 3. A plex of the enzyme and the product is produced 4. Finally the enzyme and product separate All of these steps are equilibria. Lets review each step. 27 28 29 30 31 MichaelisMenten equation 32 酶 ——是一類由活性細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用和高度專一性的特殊蛋白質(zhì)。 是否所有的酶都是蛋白質(zhì)？ 33 （ 3）核酶的發(fā)現(xiàn) 1982年， Thomas (切克 )等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲細(xì)胞的 26S rRNA前體具有自我剪接功能，將這種具有催化活性的天然 RNA稱為核酶 —Ribozyme。 1983年， Altman(阿爾特曼 )等人發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶 P的 RNA組分具有 加工 tRNA前體的催化功能 。而 RNase P中的蛋白組分沒有催化功能，只是起穩(wěn)定構(gòu)象的作用。 34 核酶的發(fā)現(xiàn)，改變了有關(guān)酶的概念，即“ 酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白質(zhì)或 RNA）。 酶分兩大類： ? 主要由蛋白質(zhì)組成 —— 蛋白類酶（ P酶） ? 主要由核糖核酸組成 —— 核酸類酶（ R酶） 35 （二 ) 酶工程研究簡史（應(yīng)用研究） ?1894年，日本的高峰讓吉用米曲霉制備得到淀粉酶，開創(chuàng)了酶技術(shù)走向商業(yè)化的先例。 ?1908年，德國的 Rohm用動物胰臟制得胰蛋白酶，用于皮革的軟化及洗滌。 ?1908年，法國的 Boidin制備得到細(xì)菌淀粉酶，用于紡織品的褪漿。 ?1911年， Wallerstein從木瓜中獲得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。 36 1949年，用微生物液體深層培養(yǎng)法進(jìn)行 ?－淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)，揭開了近代酶工業(yè)的序幕。 1960年，法國科學(xué)家 Jacob和 Monod提出的操縱子學(xué)說，闡明了酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，通過酶的誘導(dǎo)和解除阻遏，可顯著提高酶的產(chǎn)量。 37 在酶的應(yīng)用過程中，人們注意到酶的一些不足之處，如：穩(wěn)定性差，對強(qiáng)酸堿敏感，只能使用一次，分離純化困難等。 解決的方法之一是固定化。 38 固定化技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷 ?1916年， Nelson和 Griffin發(fā)現(xiàn)蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性。 ? 1969年，日本千佃一郎首次在工業(yè)規(guī)模上用固定化氨基?；笍?DL氨基酸生產(chǎn) L－氨基酸。 ?1971年，第一屆國際酶工程會議在美國召開，會議的主題是固定化酶。 39 二 . 酶工程 簡介 由酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)、基因工程技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新的技術(shù)科學(xué)。它從應(yīng)用目的出發(fā)，研究酶的產(chǎn)生、酶的制備與改