【正文】 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 I 珠江口江豚 和中華白海豚 的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué) 摘要 中華白海豚和江豚是兩種長(zhǎng)期生活在珠江口水域的 鯨豚類 ，分別是國(guó)家一級(jí)和二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。 近年來， 珠江口 水域 環(huán)境 受人類活動(dòng)影響而 污染 越來越嚴(yán)重， 對(duì)鯨豚類 產(chǎn)生巨大的威脅。因此， 目前對(duì)珠江口 鯨豚類 的保護(hù)十分緊急。 本文從保護(hù)遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)的角度，用群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的方法，對(duì)在珠江口水域生存的中華白海豚和江豚進(jìn)行了研究。 保護(hù)遺傳學(xué)研究種群的遺傳分化程度，從而為劃分獨(dú)立保護(hù)單元提供依據(jù)，是對(duì)瀕危物種進(jìn)行保護(hù)管理的基礎(chǔ)。系統(tǒng)發(fā)育 地理學(xué)研究物種分化和地理分布的關(guān)系，有助于理解珠江口水域 鯨豚類 的 進(jìn) 化歷史。 對(duì)珠江口江豚種群， 本文 首先通過用 11 對(duì)物種特異性微衛(wèi)星引物對(duì)珠江口的 75頭江豚進(jìn)行了遺傳分型，探討 了 珠江口江豚的內(nèi)部群體結(jié)構(gòu)。其次，本文提出了關(guān)于珠江口江豚的起源假說，并通過線粒體 DNA 細(xì)胞色素 b 序列 去研究 珠江口江豚 在整個(gè)新鼠海豚屬中的系統(tǒng)發(fā)育地位 。 最后，本文用中國(guó)水域 315 個(gè)江豚樣本的線粒體 DNA 控制區(qū)序列，研究了中國(guó)水域江豚種群的 結(jié)構(gòu) 和珠江口江豚種群和其他種群的分化程度，為珠江口江豚種群的保護(hù)工作提供依據(jù) 。 對(duì)珠江口中華白海豚種 群 ，本文首先研 發(fā)了 多態(tài)性較好的中華白海豚物種特異性微衛(wèi)星引物，為下一步的保護(hù)遺傳學(xué)工作打好基礎(chǔ)。其次，本文用細(xì)胞色素 b標(biāo)記研究了中華白海豚各種群和同屬的其他 白海豚 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，分析了 珠江口中華白海豚的演化歷史。 本文的主要研究結(jié)果如下： 1. 通過對(duì)珠江口 75 頭江豚個(gè)體的 11 個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星位點(diǎn)分析， STRUCTURE結(jié)果顯示 珠江口江豚的內(nèi)部群體 沒有發(fā)生 分化。 2. 通過 對(duì) 中國(guó)水域江豚 群體的分析， AMOVA 結(jié)果顯示， 珠江口江豚群體顯著 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 II 分化于其他種群 , 建議將其劃分為獨(dú)立的保護(hù)管理單元。 3. 通過 自動(dòng)校正的進(jìn) 化速率的 Bayesian 方法和細(xì)胞色素 b 基因單倍型 ， 分別 探討了 新鼠海豚屬和白海豚屬的各個(gè)種族 的 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和分化時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn) ，新鼠海豚屬內(nèi)部的分化時(shí)間為 。白海豚屬的內(nèi)部分化時(shí)間為 。 4. 通過系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究 發(fā)現(xiàn)珠江口江豚比長(zhǎng)江江豚或渤海的東亞江豚更為古老。 5. 通過 快速磁珠法（ FIASCO） 研 發(fā)了多態(tài)性較好的中華白海豚特異性引物。 關(guān)鍵詞： 中華白海豚， 江豚， 保護(hù) 遺傳學(xué)，系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)， 進(jìn)化 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 III Phylogeography of Neophocaena phocaenoides and Sousa chinensis in the Pearl River Estuary Major: Biochemistry and Molecular Biology Name: Duan Gui Supervisor: Professor, Yuping Wu ABSTRACT Chinese white dolphins (Sousa chinensis) and finless porpoise (Neophocaena phocaenoides) are two small cetaceans found residential in Pearl River Estuary (PRE). Pearl River Estuary has been developing extremely fast in the past several decades, which increased the pressure for local marine species. Our work contributes to the conservation geics and phylogeography of Chinese white dolphins and finless porpoise in PRE. Since the recent recognition of two species in the genus Neophocaena, knowledge regarding the IndoPacific finless porpoise (N. phocaenoides) remains lacking, including the population structure within the species and its phylogeic relationship with the other taxa of Neophocaena. The present study contributed to our understanding of the IndoPacific finless porpoise (N. phocaenoides) in the South China Sea by systematically sampling 75 strandings in the Pearl River Estuary (PRE). First, we examined the geic structure in the PRE. Analysis of 11 microsatellites detected no population differentiation in the PRE. Secondly, the metapopulation structure of finless porpoise populations was analyzed, including the population of N. phocaenoides in the Taiwan Strait, two populations of N. asiaeorientalis sunameri in the southern and northern Yellow Sea and two populations of N. a. asiaeorientalis in the middle and lower reaches of the Yangtze River. Pairwise FST analysis determined that the PRE population was highly differentiated from other predefined populations (, p). Finally, the tropical species N. phocaenoides, the IndoPacific 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 IV finless porpoise, may represent the most basal member in the genus Neophocaena. We estimated that the diversification of the Neophocaena began in the Late Miocene (approximately Mya). For Chinese white dolphins, we developed speciesspecific microsatellite loci using Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats (FIASCO) methods. Our analysis proved that these loci are polymorphic. We also studied the phylogeny of Sousa using cytochrome b (cyt b) sequences. Cyt b sequences of Sousa were proved to be variable in contrast with mtDNA control region sequences. Two novel cyt b are discovered in PRE and Shenzhen, respectively. Phylogeography work analysis placed PRE cyt b haplotypes in the central position between haplotypes found in South Africa and the northernwest of PRE, indicating a strong correlation between geic distance and geographical distance. Phylogeic trees reconstructed using cyt b haplotypes were of high confidence. S. plumbea was found most basal in the trees. Using BEAST, we estimated the divergence time in the genus Sousa is around (ESS=2591). Keywords: Chinese white dolphin, finless porpoise, conservation geics, phylogegraphy, evolution 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 V 目錄 第一章 引言 1 鯨豚類的保護(hù)遺傳學(xué)研究 2 珠江口鯨豚類的研究背景 3 印度 太平洋新鼠海豚的分類學(xué)和形態(tài)學(xué) 4 印度 太平洋江豚的群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)學(xué)研究背景 6 中華白海豚的分類學(xué)和形態(tài)學(xué) 10 本課題的研究意義和技術(shù)路線 13 第二章 珠江口印度 太平洋江豚的群體遺傳結(jié)構(gòu)研究 15 前言 15 材料和方法 16 結(jié)果 1 討論 3 小結(jié)和展望 5 第三章 印度 太平洋江豚的群體遺傳結(jié)構(gòu)研究 7 前言 7 研究方法 8 結(jié)果 12 討論 20 小結(jié)和展望 21 第四章 印度 太平洋江豚的系統(tǒng)發(fā)育地位研究 23 簡(jiǎn)介 23 研究方法 23 結(jié) 果 24 討論 33 小結(jié)和展望 34 第五章 FIASCO 快速磁珠法分離中華白海豚微衛(wèi)星 36 簡(jiǎn)介 36 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 VI 研究方法 37 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 45 討論 46 小結(jié)和展望 47 第六章 中華白海豚系統(tǒng)發(fā)育地位分析 47 前言 47 研究方法 48 結(jié)果 49 討論 52 小結(jié)和展望 52 第七章 珠江口擱淺的遠(yuǎn)洋型鯨豚類的分子鑒定 53 前言 53 研究方法 53 結(jié)果 54 討論 64 小結(jié)和展望 64 結(jié)論和展望 65 參考文獻(xiàn) 65 縮略語 72 附錄一 讀博期間發(fā)表的論文和摘要 73 附錄二 學(xué)術(shù)海報(bào) 73 附錄三 本實(shí)驗(yàn)所用的樣本信息 74 附錄四 珠江口擱淺江豚的性別組成 80 附錄五 序列信息 81 致謝 89 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 1 第一章 引言 系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué) 是研究物種在進(jìn)化中產(chǎn)生 空間分布 格局 的機(jī)理和過程的學(xué)科，是分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和生物地理學(xué)的交叉學(xué)科 (Avise et al., 1987)。 該學(xué)科主要在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的框架內(nèi)來重建物種的演化歷史、分類學(xué)關(guān)系 ，研究遷移方式 和 地質(zhì)事件對(duì)進(jìn)化的影響 (Avise, 2020)。由于其采用分子手段，還涉及到群體遺傳學(xué)和其他分子生物學(xué) 學(xué)科 的概念和方法 。 系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)在瀕危物種的保護(hù)研究中發(fā)揮了極大的作用。 首先，系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué) 能夠幫助理解歷史地 理隔絕 和物種分化的關(guān)系，確定物種間的分化差異 和 分類學(xué)地位。 瀕危物種的獨(dú)特性 和 遺傳上的 分化 水平 成正比 ， 分化水平越高的物種越具有保護(hù)價(jià)值 (陳小勇 et al., 2020)。 Fraser and Bernatchez (2020)認(rèn)為，在保護(hù)生物學(xué)中應(yīng)該首先確定同屬的各個(gè)種群的分化水平， 應(yīng)該優(yōu)先保護(hù)分化程度較大的種群。 隔絕假說認(rèn)為 ， 地理隔絕是物種進(jìn)化而產(chǎn)生地理分布格局的前提 條件 (Croizat et al., 1974)。地理隔絕阻止了群體間的基因流， 將祖先群體 (Ancestral population)分隔為 各自隔絕的 小群體 。中性學(xué)說（ Neutral theory）認(rèn)為， 越 小 的 群體發(fā)生遺傳漂變的幾率 越高。 遺傳漂變是物種進(jìn)化的主要原因(Templet