【正文】 63）的抗譜顯著增寬，抗性明顯增強(qiáng)，說明遺傳背景可能影響抗病主效基因的作用。分離克隆xa26基因的工作正在發(fā)表印刷之中（sun et al., 2003, plant j., in press）。另外，研究還發(fā)現(xiàn)攜帶抗白葉枯病基因xa3的近等基因系irbb3和攜帶抗白葉枯病基因xa22(t)的云南地方稻品種扎昌龍也攜帶xa26基因。因?yàn)閤a3和xa22(t)基因也被他人定位于第11號(hào)染色體長臂末端，推測(cè)xa2xa3和xa22(t)是同一個(gè)基因，這部分驗(yàn)證工作正在進(jìn)行之中。 我們采用圖位克隆法從水稻近等基因系irbb4中分離克隆了xa4基因（專利申請(qǐng)?zhí)枺海?。序列分析發(fā)現(xiàn)這該基因也編碼lrr受體激酶類蛋白質(zhì)。xa4和xa26屬于同一個(gè)基因家族的不同成員?？剐苑治霭l(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)秈稻品種特青和9311與irbb4的抗譜相同，序列分析發(fā)現(xiàn)特青和9311也攜帶xa4基因。轉(zhuǎn)基因初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示遺傳背景可能也影響xa4基因的抗性。目前，這部分工作正在完善之中。xa4和xa26基因所屬家族（命名：xa26基因家族）包括10個(gè)成員。我們對(duì)水稻品種明恢63和特青包含xa26基因家族的大約100 kb區(qū)段進(jìn)行了測(cè)序，對(duì)比公共數(shù)據(jù)庫中的水稻品種日本晴和9311的同源區(qū)段的序列，分析了抗病基因的進(jìn)化模式。涉及這部分工作的論文正在撰寫之中。(t)在雜交水稻恢復(fù)系明恢63中鑒定了一個(gè)新的抗白葉枯病顯性基因xa25(t)。該基因在苗期和成株期都能特異性的抗白葉枯病菌生理小種pxo339。通過分析攜帶xa25(t)基因的重組自交系群體，將該基因定位于水稻第12號(hào)染色體的著絲粒區(qū)。在該著絲粒區(qū)段已經(jīng)定位了多個(gè)水稻抗稻瘟病基因，推測(cè)xa25(t)基因與抗稻瘟病基因緊密連鎖或等位。涉及xa25(t)基因的研究工作已發(fā)表（chen et al., 2002, phytopathology 92:750754）。利用水稻品種明恢63，構(gòu)建了全生育期平衡化cdna文庫。該文庫由水稻不同生長時(shí)期和不同生理狀態(tài)下的15種不同組織的cdna組成，包括白葉枯病菌和稻瘟病菌接種誘導(dǎo)后的組織。該文庫包含大約62,000個(gè)克隆， kb（chu et al., 2003, chinese science bulletin 48:229235）。對(duì)該文庫中的大約4萬個(gè)cdna克隆進(jìn)行了測(cè)序，獲得兩萬多個(gè)非重復(fù)est序列。利用該文庫我們建立了高效cdna芯片（包括cdna array和cdna microarray）分析體系。我們發(fā)展了一種新的計(jì)算機(jī)分析方法，用于分析大規(guī)模est測(cè)序中所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，以獲得高質(zhì)量、非重復(fù)表達(dá)序列。該方法在聚類過程中采用megablast工具對(duì)一致序列進(jìn)行序列同源比較，并用phrap程序?qū)γ恳籩st簇進(jìn)行拼接檢驗(yàn)。這一聚類策略能降低測(cè)序錯(cuò)誤帶來的影響，有效識(shí)別基因家族成員，并避免選擇性剪接的干擾。與ncbi（national center for biotechnology information）的unigene clustering方法相比，estclustering的聚類結(jié)果可以更好地反映表達(dá)序列的多樣性。涉及這部分工作的論文已經(jīng)發(fā)表（張利達(dá)等，2003,遺傳學(xué)報(bào)30:147153）。利用植物nbs－lrr類抗性基因的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)pcr引物從水稻基因組中擴(kuò)增同源序列，經(jīng)克隆測(cè)序確定后獲得了23個(gè)不同的nbs片段（稱為抗性基因同源序列，簡記為rs）。將這些rs序列在窄葉青/京系17 的重組自交系（ril）構(gòu)建的分子圖譜上定位，定位結(jié)果表明它們分布在1，3，4，7，8，9，10 和11染色體。其中10個(gè)rs位于已知r基因所在的染色體區(qū)間。這些rs標(biāo)記可以作為圖位克隆同一位點(diǎn)上相應(yīng)抗病基因的起點(diǎn)。有關(guān)結(jié)果已發(fā)表（zheng et al，2001,cience in china(series c), 44(3): 253262）。9．構(gòu)建了含xaxa5和xa13三個(gè)抗性基因的irbb56基因組bac文庫 利用含xaxa5和xa13三個(gè)水稻白葉枯病抗性基因的累加系irbb56構(gòu)建了一個(gè)水稻細(xì)菌人工染色體文庫。該文庫包含55296個(gè)克隆，平均插入片段為132 kb。按水稻基因組為450 mb計(jì)，該文庫覆蓋14倍基因組，％。用均勻分布的3個(gè)葉綠體基因和4個(gè)線粒體基因克隆作探針篩選文庫，結(jié)果顯示該文庫中含細(xì)胞器基因組dna同源序列的克隆數(shù)小于1％。用分布于水稻3條不同染色體、分別與xaxa5和xa13連鎖的dna標(biāo)記篩選文庫，分別檢測(cè)出11106個(gè)陽性克隆，為克隆這些基因打下了基礎(chǔ)。該文庫對(duì)水稻基因組的高度覆蓋率和較大的插入片段，非常適合于物理作圖和基因的分離和克?。ㄍ跷拿鞯?，2001，遺傳學(xué)報(bào), 28(2)：120－128；wang et al., 2001, molecular genetics and genomics, 265: 118125）。本研究中建立的提取高質(zhì)量水稻基因組dna方法和高效轉(zhuǎn)化方法被成功地用于中國超級(jí)雜交稻測(cè)序(science, 2002,296: 7992)?？寺×艘粋€(gè)nbslrr類抗性基因家族用水稻抗白葉枯病基因xa4的近等基因系和基因累加系對(duì)克隆的nbslrr同源序列rs13進(jìn)行rflp分析，發(fā)現(xiàn)序列rs13來自xa4基因位點(diǎn)（wang et al, 2000, chinese science bulletin, 45(19): 17791782）。利用克隆的抗病同源序列rs13作為探針，從水稻ir64的bac文庫中篩選到4個(gè)陽性克隆，其中一個(gè)克隆14e19能夠覆蓋其余3個(gè)克隆。對(duì)14e19進(jìn)行了全序列測(cè)定和分析，獲得了73kb的全長dna序列，基因預(yù)測(cè)顯示其上有4個(gè)編碼nbslrr的基因，分別命名為nla－d。同時(shí),對(duì)近等基因系irbb56同一基因組位臵的bac克隆106p13進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其上有10個(gè)nl同源拷貝，其中有4個(gè)同14e19上的nl一樣，說明nl是一個(gè)至少有10個(gè)成員（分別命名為nla—nlj）的基因家族。搜索日本晴、931廣陸矮4號(hào)的序列，發(fā)現(xiàn)三者也有多個(gè)高度同源的序列。對(duì)nl基因進(jìn)行rtpcr和cdna庫篩選分析，發(fā)現(xiàn)nlb能夠在含抗白葉枯病基因xa4水稻品系irbb4中特異表達(dá)，說明nlb參與了白葉枯病抗性反應(yīng)。把這些同源拷貝作為新的抗病基因進(jìn)行研究，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)正在證實(shí)這些同源拷貝的功能。1定位克隆了隱性抗白葉枯病基因xa5的候選基因本研究利用rflp、caps等標(biāo)記方法對(duì)xa5近等基因系ir24和irbb5構(gòu)建的f2群體共5000個(gè)單株進(jìn)行群體連鎖分析，構(gòu)建了xa5的精細(xì)遺傳圖譜。在此基礎(chǔ)上我們用 與xa5基因緊密連鎖的標(biāo)記篩查含有xa5 的水稻累加系irbb56的bac文庫，構(gòu)建了包含xa5基因位點(diǎn)的精細(xì)物理圖譜（zhong et al, chinese science bulletin, in press）。將xa5限定在12kb的片段上，在此區(qū)間發(fā)現(xiàn)唯一一個(gè)候選基因，與已知抗病基因具有不同的結(jié)構(gòu)。該基因與顯性等位基因編碼的氨基酸序列有差異。目前功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)已獲得轉(zhuǎn)基因植株。12．開展了抗白葉枯病基因xa3和xa13的精細(xì)定位與圖位克隆本研究利用ir24與含xa3基因的近等基因系irbb3組合構(gòu)建了約2000單株的f2定位群體，并利用國際水稻基因組和中國超級(jí)雜交稻基因組計(jì)劃所公布的第11染色體長臂上的序列設(shè)計(jì)出一系列sslp和caps標(biāo)記，對(duì)xa3進(jìn)行精細(xì)定位，將xa3基因定位于caps標(biāo)記y3和ssr標(biāo)記rm144之間。目前，我們又利用日本晴和irbb3組合構(gòu)建了約5000單株的f2群體，對(duì)xa3基因作進(jìn)一步精細(xì)定位。利用xa13的近等基因系構(gòu)建了包含4000單株的f2群體，將xa13基因界定在第8染色體80kb的區(qū)間。對(duì)這個(gè)區(qū)間進(jìn)行dna測(cè)序和基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了可能的候選基因，正對(duì)這些候選基因進(jìn)行共分離分析和功能互補(bǔ)分析，有望獲得突破。1分離克隆了抗稻瘟病相關(guān)基因本研究利用cdnaaflp和組池分離分析(bsa)相結(jié)合的方法來檢測(cè)稻瘟病抗池和感池中特異表達(dá)的基因。在大約20122個(gè)檢測(cè)到的位點(diǎn)中，一共獲得了12個(gè)差異表達(dá)的條帶(debs)，8個(gè)來自抗池，4個(gè)來自感池。利用水稻的dh群體對(duì)它們進(jìn)行遺傳定位結(jié)果表明其中的5個(gè)debs，r1, r8, s9, s16和s17被定位在第一染色體的一個(gè)抗稻瘟病的qtl所在的區(qū)間。序列分析和等位分析發(fā)現(xiàn)r1和s16，r8和s9分別來自二對(duì)等位基因位點(diǎn)，而且r1(s16)，s17和r8(s9)分別位于第一染色體上三個(gè)緊密相連的bac/pac克隆中，這更進(jìn)一步證實(shí)了r1(s16)，s17和r8(s9)在第一染色體上qtl包含區(qū)間中的緊密連鎖關(guān)系。逆向northern blotting和定量rtpcr分析表明r1(s16)，s17和r8(s9)在接種稻瘟病菌后的表達(dá)水平都是上調(diào)的，這暗示它們都參與了稻瘟病抗性反應(yīng)過程。有關(guān)結(jié)果已投送國際學(xué)術(shù)刊物。二、研究水平與創(chuàng)新性本研究是在基因的水平上發(fā)掘水稻的抗病種質(zhì)，重點(diǎn)是克隆符合“基因?qū)颉奔僬f的，以過敏性抗病反應(yīng)為基礎(chǔ)的水稻抗病基因。已克隆的多種植物的抗病基因在序列結(jié)構(gòu)上分為五種類型，而迄今正式見諸于報(bào)導(dǎo)的克隆的水稻抗病基因只有4個(gè)，即抗白葉病基因xa21和xa1，抗稻瘟病基因pib和pita。它們分屬于二種不同的結(jié)構(gòu)類型。這對(duì)于全面深入了解水稻抗病基因的本質(zhì)還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，而且也不能滿足育種上對(duì)抗病基因的需求，而這二個(gè)方面正是本研究重點(diǎn)解決的科學(xué)問題。本研究特色在于應(yīng)用水稻基因組研究的遺傳作圖和物理作圖的綜合技術(shù)以及在基因組測(cè)序基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因預(yù)測(cè)方法，充分利用水稻基因組較小的特征，從多種途徑發(fā)現(xiàn)抗病和感病的水稻材料的遺傳差異，克隆水稻的抗病基因。本課題克隆xa26和xa4等顯性抗病基因補(bǔ)充和發(fā)展了植物抗病基因的研究結(jié)果，而且克隆的幾個(gè)抗病基因均有重要的實(shí)用價(jià)值，研究結(jié)果將促進(jìn)水稻抗病分子育種的發(fā)展。雖然近年來抗病基因研究取得許多突破，但是我們也發(fā)現(xiàn)已克隆的植物抗病基因多為顯性基因，隱性抗病基因的研究進(jìn)展不大。隱性抗病基因的研究成為目前植物抗病研究的新問題。為此我們?cè)诒菊n題后期啟動(dòng)了水稻隱性抗病基因xa5和xa13的克隆，這一研究具有很高的創(chuàng)新性。目前已將xa5限定在12kb的片段上，在此區(qū)間發(fā)現(xiàn)并分離出一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子的候選基因，與已知抗病基因具有不同的結(jié)構(gòu)。該基因一旦證實(shí)，將成為植物抗病基因研究的重要突破。對(duì)隱性抗病基因進(jìn)行克隆和研究，有助于全面解析植物的抗病機(jī)制以及抗病新思路的提出。篇三：973計(jì)劃項(xiàng)目結(jié)題驗(yàn)收辦法 973計(jì)劃項(xiàng)目結(jié)題驗(yàn)收辦法973計(jì)劃項(xiàng)目實(shí)施期滿應(yīng)進(jìn)行結(jié)題