【正文】 ..................................................................................................31 致 謝 ..........................................................................................................................32 參考文獻(xiàn) ..........................................................................................................................33 附 錄 ............................................................................................................................35 1 1 緒論 稻谷是一種重要的糧食作物，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約一半的人口都以稻谷為主 [1]，世界人口食物熱量的 21%取自稻谷。在發(fā)展中國(guó)家，約有 60%的蛋白來(lái)源于谷物，在未來(lái)幾十年，谷物仍是世界三分之二人口的主要蛋白來(lái)源。稻谷也是我國(guó)最主要的糧食作物之一，目前，我國(guó)水稻的播種面積約占糧食作物總面積的四分之一，產(chǎn)量約占全國(guó)糧食總產(chǎn)量的二分之一，在商品糧中占一半以上。其中早稻產(chǎn)量約占 稻谷總量的四分之一，但早稻因其籽粒結(jié)構(gòu)較松、直鏈淀粉含量較高、米粒粘性小、口感差等不良的食用品質(zhì)，他在人們的日常飲食中受到冷落，大量的早稻已經(jīng)并將更多的用于發(fā)酵工業(yè)和淀粉糖的生產(chǎn)。 另外，庫(kù)存陳化大米和稻谷加工過程中的碎米也將直接用作工業(yè)生產(chǎn)的原料。這些工業(yè)生產(chǎn)利用的是大米中的淀粉，而蛋白質(zhì)則沉積于副產(chǎn)品米渣中。目前，我國(guó)約有上千家葡萄糖和味精生產(chǎn)廠家，其中一半采用大米淀粉制糖發(fā)酵，其廢渣多以干粉的形式賣給飼料廠。米渣中蛋白質(zhì)含量高 40%~70%。遠(yuǎn)大于大米甚至大豆中蛋白質(zhì)含量 [2]，大米蛋白的品質(zhì)是公認(rèn)的 谷類蛋白中的上佳品，它不含影響食物利用的毒性物質(zhì)和酶阻礙物，而且大米蛋白具有良好的氨基酸組成配比，消化率極高，是一種優(yōu)良的植物蛋白 [3]。 大米蛋白的性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 大米蛋白組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 大米主要由兩大成分組成，主要成分為淀粉，約占大米總量的 80%，其次為大米蛋白約占大米總量的 8%。大米蛋白種類很多，一般以其溶解特性進(jìn)行分類。首先用水提取大米或米糠中的蛋白質(zhì)所得到的蛋白組分稱為清蛋白；殘?jiān)孟←}溶液提取得到的蛋白組分為球蛋白；再用 75％乙醇提取的組分為醇溶蛋白，最后殘?jiān)械鞍踪|(zhì)只能用 酸或堿溶解，分別稱為酸溶性蛋白和堿溶性蛋白，二者統(tǒng)稱為谷蛋白。 谷蛋白和醇溶蛋白也叫貯藏蛋白，是大米中的主要蛋白成分，谷蛋白占總蛋白的 80％ [4]以上，醇溶蛋白占 10％左右；而清、球蛋白含量極少，是大米中的生理活性蛋白，在稻谷發(fā)芽早期，它們起著重要的生理作用。 不同蛋白氨基酸組成各有特點(diǎn)。清蛋白中不帶電荷的疏水性氨基酸含量較高，酸性氨基酸較低；球蛋白中堿性氨基酸含量較高，達(dá) 15%以上，而醇溶性蛋白的堿性氨基酸含量只有球蛋白中的一半左右，但其疏水性氨基酸卻遠(yuǎn)高于其它類蛋白。 2 蛋白的溶解性不僅與其氨基酸組 成有關(guān)，與其存在狀態(tài)也有關(guān)系。研究表明[8]，在胚乳中蛋白主要以兩種聚集體形式存在，即 PBI 和 PBⅡ型。電子顯微鏡觀察表明， PBI 聚集體呈片層結(jié)構(gòu)，致密顆粒直徑為 ～ 2μ m，醇溶蛋白即存在于 PBI 中；而 PBⅡ呈橢球形 、 不分層 、 質(zhì)地均勻，顆粒直徑約 4μ m，其外周膜不明顯，谷蛋白和球蛋白存在于 PBⅡ中。兩種聚集體常相伴存在。 大米蛋白中的胱氨酸含量較高，含有較多的 SS鍵。這些鏈內(nèi)或鏈間 SS鍵使蛋白質(zhì)多肽鏈聚集成致密分子，也可能是形成蛋白聚合體的重要原因。聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ PAGE） 分析 [5]結(jié)果顯示，在 PBⅡ聚集體中的蛋白質(zhì)含有分子量 6 1 2 3 380 和 500 kDa 甚至超過 2020 kDa 的組分。分子生物學(xué)的研究表明，大米貯藏蛋白的基因表達(dá)時(shí)首先合成的是分子量為 57 kDa的蛋白分子，它再裂解成 22 kDa 和 37 kDa 兩個(gè)亞基。谷蛋白中大小不等的蛋白分子由這兩個(gè)亞基通過 SS裝配而成。 SDS 可以破壞 SS的連接，改變 SDS 的用量，可以發(fā)現(xiàn)分子量為 22～ 23 kDa 和 37～ 39 kDa 的組分存在，因此這兩個(gè)組分實(shí)際上是大分子聚集體的基本組成單位。 清蛋白中也有分子量 [5]高達(dá) 100 kDa 的蛋白組分存在，但由于清蛋白中胱氨酸含量很低，不易形成 SS鍵，因而清蛋白更容易溶于水，這說(shuō)明二硫鍵的存在對(duì)穩(wěn)定蛋白聚合體是非常重要的。 將蛋白提取后對(duì)其氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn) [6]，大米中的某些蛋白并非完全由氨基酸組成的簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)，而是含有糖或脂類成分的結(jié)合蛋白。這些非氨基酸成分不僅影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)，同時(shí)也賦予蛋白質(zhì)特殊的生理功能。 大米蛋白的營(yíng)養(yǎng)和保健作用 研究表明 [5]，大米蛋白是優(yōu)質(zhì)蛋白，它具有氨基酸組成合理和低過敏性特點(diǎn)，是蛋白質(zhì)中佼佼者。大 米蛋白質(zhì)中蛋氨酸含量高達(dá) ％ ，這是其它植物蛋白質(zhì)甚至很多動(dòng)物蛋白質(zhì)也無(wú)法比擬的。 大米蛋白質(zhì)中精氨酸含量也較高，很適宜在嬰幼兒食品中添加。大米蛋白質(zhì)在學(xué)前兒童體內(nèi)真消化率 （ TD） 、生物價(jià) （ By） 、和凈蛋白質(zhì)利用率 （ NPU） [7]分別為 ％、 ％、 ％ ；而成年人這三項(xiàng)指標(biāo)分別為 ％、 ％、％，故大米蛋白用于兒童食品更好。大米蛋白氨基酸組成平衡合理，與 WHO/ FAO 推薦理想模式非常接近。 大米蛋白低抗原性是其有別于其它植物蛋白食物另一個(gè)特點(diǎn)。很多植物性蛋白中含有抗 營(yíng)養(yǎng)因子，如大豆和花生是常用的植物蛋白質(zhì)來(lái)源，但大豆和花生含有對(duì)人體有害的胰蛋白酶抑制素和凝血素，在大豆中還含有脹氣因子棉子糖和水蘇糖等：動(dòng)物性食品中也有一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，如 [5]牛奶中 β乳球蛋白、雞蛋清中卵類粘蛋白等，使食用者可能會(huì)產(chǎn)生過敏或中毒反應(yīng)，特別是嬰幼兒對(duì)這些因子 3 最為敏感。而大米蛋白不含類似致敏因子，安全可靠?，F(xiàn) 世界上很多國(guó)家都以大米蛋白營(yíng)養(yǎng)粉作為嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)的蛋白補(bǔ)充劑。 研究 [5]發(fā)現(xiàn)，大米蛋白不僅具有重要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有重要保健功能，如抗糖尿病、抗膽固醇、抗癌變等。 加熱和陳化作用對(duì) 大米蛋白的影響 研究表明 [8]，大米中的蛋白種類并不是固定不變的。在大米陳化過程中，雖然總蛋白含量不變，但其結(jié)構(gòu)、類型會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而也影響了米飯的流變特性，突出的變化是二硫鍵數(shù)量增多，蛋白質(zhì)分子量增大，蛋白聚體更加致密，蒸煮后蛋白質(zhì)與淀粉的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密，限制了淀粉粒的吸水膨脹和柔潤(rùn)，因而米飯的粘性下降而硬度增加。此時(shí)若加入適量的還原劑破壞二硫鍵，則米飯的粘性提高。 大米蛋白不僅在陳化中有更大分子的形成，在加熱時(shí)也有明顯的蛋白分子的聚合。 Mujoo 指出 [9]，爆炒大米花時(shí)，分子量為 2 3 68 kDa 的 分子可以聚集成 4 104 kDa 的特大聚合體，但分子量為 13～ 16 kDa 的醇溶蛋白不參與這種蛋白體的形成。由此可見，開發(fā)利用大米蛋白質(zhì)尤其要注意大米陳化、加熱和二硫鍵的氧化、還原對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響。 米糠中四類蛋白的含量與大米中的明顯不同。其依次用水、鹽、醇、酸、堿溶液提取所得到的清、球、醇溶、酸溶和堿溶蛋白的含量分別為 34％、 15％、 6％、11％和 32％，其中酸溶蛋白和堿溶蛋白均為谷蛋白，也就是說(shuō)，米糠中水溶性蛋白含量很高。色譜分析表明，前四種蛋白的分子量范圍 [10]分別為 10～ 100kDa、 l0～150kDa、 33～ 150kDa 和 25～ 100kDa。堿溶性蛋白在提取過程中有二硫鍵的斷裂，其主要組分的分子量仍然分布在 45～ 150kDa，所有這類谷蛋白分子量更大，更難溶于水。但如果打破二硫鍵，也可以使 98％以上的米糠蛋白溶解出來(lái)。需要指出，米糠經(jīng)穩(wěn)定化處理 （ 一般是加熱滅酶 ） 前后，其各種蛋白成分含量變化很大，主要表現(xiàn)在清蛋白含量降低 （ 變性所致 ） 、谷蛋白含量明顯增加。 大米蛋白的開發(fā)利用 開 發(fā)大米蛋白主要產(chǎn)品形式有 [5]：改善大米蛋白的物化功能性用作食品添加劑，制取高蛋白營(yíng)養(yǎng)粉 (蛋白含量 80％以上 )和具有特殊功能的生物活性肽等。它們?cè)诩夹g(shù)上共同點(diǎn)是大米分離蛋白 （ RPI） 水解和改性。 食品添加劑 食品添加劑是一類能改善食品價(jià)格性能或色、香、味的添加物。合適的分子大小及氨基酸組成都會(huì)賦予蛋白質(zhì)一定的物化性能，如溶解性、發(fā)泡性、乳化性等。蛋白質(zhì)添加于食品中不僅有利于改善食品的加工性能，還會(huì)大大增加食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。大米蛋白本身溶解性差，但經(jīng)水解后，可釋放出一定的氨基和羧基，增大蛋白分子極性， 在增大其溶解性同時(shí)，其發(fā)泡、乳化等性質(zhì)也表現(xiàn)出來(lái)。 4 蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng) 補(bǔ)充劑近年來(lái)，大米蛋白因其較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和低過敏性特點(diǎn)，在國(guó)外受到廣泛關(guān)注， Nutribiotic 和 Habib?Arkady 等知名公司都投入很大力量從事大米蛋白開發(fā)研究，其產(chǎn)品已進(jìn)入我國(guó)市場(chǎng)。大米蛋白營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑主要是蛋白質(zhì)深度水解，其首要目標(biāo)是提高蛋白溶解度，其次是便于食用，即沖即飲的粉劑和口服液便是較好的產(chǎn)品形式。過去對(duì)蛋白質(zhì)水解強(qiáng)調(diào)制備氨基酸，但現(xiàn)代研究表明，小肽分子比游離的氨基酸更容易被人體腸道吸收和利用。食物中蛋白質(zhì)消化吸收實(shí) 際上也是被消化道蛋白酶水解成小肽后，利用腸粘膜紋狀緣存在的肽載體主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制來(lái)完成的。 功能肽開發(fā) 目前對(duì)水解蛋白質(zhì)產(chǎn)品活性肽的研究成為熱門課題，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種具有潛在應(yīng)用價(jià)值活性肽 。對(duì)大米來(lái)源的活性肽目前報(bào)道 [11]較多的是 GlyTyrProMet TyrproLeuArg 肽分子，命名為 C8 肽 （ Oryzatensin） 。 在豚鼠試驗(yàn)表明 ， C8 肽（ Oryzatensin） 具有引起回腸收縮、抗嗎啡和免疫調(diào)節(jié)作用，且主要是通過激活磷脂酶水解溶血磷脂酸釋放花生四烯酸來(lái)引起收縮的。其作用機(jī)理與 人體補(bǔ)體C3a[12]引起的回腸收縮方式類似，且其氨基酸與 C3a 肽羧基末端第 70～ 77 序列有相同的特征。大米蛋白水解還可產(chǎn)生某些風(fēng)味肽，當(dāng)酶解產(chǎn)物與糊精混合經(jīng)噴霧干燥即得到市售食品風(fēng)味改良劑。 大米蛋白的制備和生產(chǎn)現(xiàn)狀 大米蛋白的制備技術(shù) 大米蛋白提取目的是為了獲取高純度大米蛋白產(chǎn)品，一般分為大米濃縮蛋白[7]( I C，蛋白質(zhì)含量 89％ )和大米分離蛋白 (RPI，蛋白質(zhì)含量 90％以上 ) 。大米、米糟、米糠等原料都可用來(lái)制備大米蛋白，圍繞大米蛋白開發(fā)和利用，研究者提出各種不同制備方法，主要有 ：溶劑提取、酶法提取、堿法提取、復(fù)合提取法。 （ 1）溶劑提取法 表 1 用以提取大米蛋白的溶劑 溶劑組成 物質(zhì) 5 表面活性劑 脂肪酸鹽 弱酸 氫鍵破壞劑 還原劑 十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨 脂肪酸鹽 醋酸、乳酸 尿素、鹽酸胍 巰基乙醇、 DTT 王章存等研究對(duì)比由米渣為原料，分別采用非堿性溶劑和堿法提取大米蛋白效果 。 結(jié)果 表明： 非堿性溶劑提取 [13]所得產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量和堿 法提取相當(dāng)，但其蛋白回收率明顯提高，可達(dá) ％，而堿法提取回收率最高時(shí)也只有 40％左右 。顯然，采用非堿性溶劑提取大米蛋白具有一定優(yōu)勢(shì)，但提取溶劑不易去除，產(chǎn)品應(yīng)用時(shí)存在安全性問題，特別是在食品應(yīng)用中；況且生產(chǎn)成本會(huì)因使用提取溶劑而上升不少。 （ 2）酶法提取法 酶法提取是利用蛋白酶對(duì)大米蛋 的 白降解和修飾，使其變成可溶性肽而被提取 出 來(lái) 。這種方法反應(yīng)條件溫和，蛋白質(zhì)多肽鏈可水解為短肽鏈，提高蛋白質(zhì)溶解性 。按照蛋白酶作用方式不同，蛋白酶有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶之分。外切蛋白酶從肽鏈任意一端切下一個(gè)單位氨基酸 殘基；工業(yè)用蛋白酶主要是內(nèi)切蛋白酶，內(nèi)切蛋白酶在多肽鏈內(nèi)部破壞肽鍵，依賴不同水解程度產(chǎn)生一系列分子量不同多肽。內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶對(duì)底物作用方式差異會(huì)影響蛋白質(zhì)提取。按照蛋白酶作用條件不同，又可分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶等 。至于制備大米蛋白具體采用何種蛋白酶更加合適，不同研究，由于采用酶來(lái)自不同生產(chǎn)廠商，酶活力、組成等存在不同，采用原料不盡雷同，提取工藝也不盡相同等諸多因素，結(jié)論有所差異。 （ 3）堿法提取法 [14] 堿法主要是根據(jù)大米蛋白中有 80％ 以上蛋白可溶于堿溶液原理，先通過堿溶離心去 除大部分雜質(zhì)，然后調(diào)整上清液 pH 值，使其達(dá)到大米蛋白等點(diǎn)電，讓大部分蛋白沉淀下來(lái)，再次離心分離清液中雜質(zhì)。該法工藝簡(jiǎn)單，是研究較多 的辦法。 堿法提取缺陷主要是在高堿濃度提取情況下，會(huì)引起蛋白質(zhì)劇烈變性，且Maillard[14]反應(yīng)加劇，產(chǎn)生褐色物質(zhì)，再加上高堿濃度下非蛋白物質(zhì)溶解，這都會(huì)影響最終蛋白產(chǎn)品品質(zhì)。同時(shí)，堿環(huán)境會(huì)導(dǎo)致某些氨基酸如賴