【正文】 稱為 雜種核酸分子 。 （ 1） Southern雜交（ Southern印跡）： 用適當(dāng)?shù)南拗泼赶郎y(cè) DNA，電泳后，將凝膠浸于堿性溶液中以變性 DNA，再經(jīng)毛細(xì)作用將變性的DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移至雜交膜上并固定，然后與放射性同位素標(biāo)記的核酸探針雜交，再經(jīng)放射自顯影顯示雜交結(jié)果。該技術(shù)可有效地分析基因結(jié)構(gòu)或檢測(cè)待測(cè) DNA樣本中是否含有特定的序列。1)電泳 :將已酶切的待檢 DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。2)轉(zhuǎn)膜 :將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到濾膜上（ 印跡 轉(zhuǎn) 移）。3)雜交 :將濾膜與標(biāo)記的 DNA或 RNA探針進(jìn)行雜交。印跡法： 凝膠印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法。雜交膜： 尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜等。放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移 探針雜交－＋雜交模式圖 某作者用人的一放射性 DNA探針與鼠基因組 DNA進(jìn)行雜交，在所得到的雜交圖譜中，第 1泳道的點(diǎn)樣處有一略呈拖尾狀的放射性雜交斑點(diǎn)；第 2泳道呈較長(zhǎng)的彌散形雜交帶；第 3泳道有 3條較清晰的雜交條帶，上下兩條帶的顯色程度相當(dāng)，中間的條帶顯色最深，約分別為其上下兩側(cè)條帶的兩倍。試分析上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。例題：216。 Southern雜交應(yīng)用舉例環(huán)狀芽孢桿菌基因啟動(dòng)子的分離與鑒定環(huán)狀芽孢桿菌 C2基因啟動(dòng)子探針與重組 DNA分子的斑點(diǎn)雜交（ 2）斑點(diǎn)雜交 （ Dot blot）：直接將 DNA樣品點(diǎn)在濾膜上使之成為斑點(diǎn)，變性并固定，與探針雜交，放射自顯影。檢測(cè)重組體克隆的菌落雜交技術(shù)檢測(cè)重組體克隆的菌落雜交技術(shù)（ 3）菌落原位雜交 （ Hybridization in situ)： 又分為菌落雜交和空斑雜交。在雜交膜上接種轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，裂解以釋放待檢 DNA，變性并固定 DNA，與探針雜交，放射自顯影。 用于鑒定陽(yáng)性重組體。（ 4）組織原位雜交 （ Tissue in situ hybridization）： 指組織或細(xì)胞的原位雜交。經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與 DNA或 RNA雜交，以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置。Localization of RNA 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction， PCR）216。 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史技術(shù)簡(jiǎn)史 PCR原理 PCR是一種體外無(wú)性擴(kuò)增 DNA的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。待擴(kuò)增 DNA片段經(jīng)高溫變性成為單鏈后，在低溫（如 52℃ ）下與寡聚核苷酸引物退火，然后在中溫下以每一條單鏈為模板，由多聚酶催化延伸引物鏈，分別合成一條新鏈。經(jīng)過(guò)解鏈、退火和鏈延伸等多個(gè)循環(huán)反應(yīng)，原 DNA片段就可得到大量擴(kuò)增。注 : Taq來(lái)自 Thermus aquaticus PCR儀 PCR反應(yīng)體系 Tmplate DNA DNA Primers dNTPs Taq DNA Polymerase 10 Buffer 基本反應(yīng)步驟 1個(gè)循環(huán)包括 高溫變性、低溫退火和中溫延伸 反應(yīng) 。經(jīng) n次循環(huán)后 , 一個(gè) DNA分子可 擴(kuò)增 為 2n個(gè)分子。① 模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至 94℃ 左右一定時(shí)間后，使模板 DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便與引物結(jié)合。Primer 1Primer 25’3’5’5’3’3’② 模板 DNA與引物的退火 (復(fù)性 )：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃ 左右，引物與模板DNA單鏈上的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。3’3’5’Primer 1Primer 25’3’5’5’3’5’ 3’3’Taq DNAPolymerase③ 引物的延伸： DNA模板 引物結(jié)合物在 Taq DNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)原則，合成一條新的與模板 DNA互補(bǔ)的鏈。 一般每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。1個(gè) PCR循環(huán)產(chǎn)生 2條雙鏈分子PCR的基本原理模板 DNAPCR的基本原理? PCR反應(yīng)條件? PCR過(guò)程? PCR的特點(diǎn)引物 1引物 2PCR的基本原理? PCR反應(yīng)條件? PCR過(guò)程? PCR的特點(diǎn)引物 1引物 2Taq酶Taq酶PCR的基本原理? PCR反應(yīng)條件? PCR過(guò)程? PCR的特點(diǎn)第 1輪結(jié)束PCR的基本原理? PCR反應(yīng)條件? PCR過(guò)程? PCR的特點(diǎn)TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理? PCR反應(yīng)條件? PCR過(guò)程? PCR的特點(diǎn)第 2輪結(jié)束? PCR反應(yīng)條件? PCR過(guò)程? PCR的特點(diǎn)重復(fù) 30輪后230=1,073,741,824第 1輪擴(kuò)增第 2輪擴(kuò)增第 3輪擴(kuò)增第 4輪擴(kuò)增 第 5輪擴(kuò)增第 6輪擴(kuò)增電泳分析PCR設(shè)備電泳分析（ 3） PCR的應(yīng)用? 反向 PCR： 擴(kuò)增已知序列旁側(cè)的未知 DNA序列 ? 錨定 PCR: 用于測(cè)定基因結(jié)構(gòu)? 不對(duì)稱 PCR: 用于擴(kuò)增某一單鏈模板? RTPCR(逆轉(zhuǎn)錄 PCR): 逆轉(zhuǎn)錄聯(lián)合 PCR以擴(kuò)增 cDNA? 復(fù)合 PCR: 用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾條 DNA片段? 易錯(cuò) PCR： 引入 錯(cuò)配 堿基，導(dǎo)致隨機(jī)突變? 熒光定量 PCR: 用于估計(jì)模板 DNA的濃度? 免疫 PCR： 擴(kuò)增抗原 抗體復(fù)合物上的 DNA分子 ? 原位 PCR： 在組織或細(xì)胞標(biāo)本片上直接進(jìn)行 PCR? 微生物 PCR: 用于微生物的鑒定和分類216。 設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則 ：① 引物長(zhǎng)度： 1530bp，常為 20nt左右。② 引物擴(kuò)增跨度：以 200500bp為宜。③ 引物堿基： G+C含量以 4060%為宜。避免 5個(gè)以上相同堿基的成串排列。④ 引物內(nèi)部應(yīng)避免出現(xiàn)出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)。⑤ 引物 3ˊ 末端堿基，應(yīng)與模板單鏈 嚴(yán)格 配對(duì)。⑥ 引物中具有或能夠加上合適的酶切位點(diǎn)。⑦ 特異性：與數(shù)據(jù)庫(kù)中的其它序列無(wú)明顯同源性。pPICZα 物理圖譜 定向克隆應(yīng)用舉例Primer F： 5ˊ GCT GAA TTC ATG GGC AAC TCA GCG CTC GAC CTT 3ˊPrimer R： 5ˊ TGT TCT AGA TTA GAC GTT ACC GGC GGC GCC AGT 3ˊ 上、下游引物的 5ˊ 端分別設(shè)有 1個(gè) EcoR Ⅰ 和 1個(gè) Xba Ⅰ 酶切位點(diǎn)（黑體字母表示）及 3個(gè)保護(hù)堿基。 定向克隆應(yīng)用舉例 PCR引物設(shè)計(jì)粗毛栓菌熱激蛋白 cDNA PCR擴(kuò)增 引物設(shè)計(jì) :5′CTTCCACGACGCTATC//GAGAGATTCGCCTGCA 3′216。 關(guān)于 PCR引物設(shè)計(jì)例題 1： 根據(jù)以下 cDNA編碼區(qū)片段的兩末端已知序列，如何設(shè)計(jì)下游引物，以擴(kuò)增該 cDNA片段。例題 2: 如何利用網(wǎng)絡(luò)技術(shù)和 DNA分析軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物 , 以 PCR擴(kuò)增某蛋白的 cDNA?演示 : (1)登錄 NCBI等網(wǎng)站 ,收集有關(guān) cDNA序列信息 。 (2)利用 DNA分析軟件 (如 ,DNAman等 )對(duì)所收集的 cDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析 ,利用最保守序列設(shè)計(jì)引物。216。 再論 cDNA38種 MnP同工酶 cDNA序列的同源性比較右側(cè) 1列符號(hào)表示相應(yīng)的cDNA序列在 GenBank中的登錄號(hào)216。 核酸序列分析 : 即核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。 Maxam、 Gilbert的化學(xué)測(cè)定法和 Sanger的酶法。 核苷酸序列分析酶法測(cè)序 (Sanger) 化學(xué)測(cè)序法 (MaxamGilbert) 待測(cè) DNA片段 待測(cè) DNA片段 ↓ ↓ 次克隆 5’末端標(biāo)記