蕎麥內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的擴(kuò)增及序列分析-四川農(nóng)業(yè)大學(xué)-文庫(kù)吧
2025-06-02 23:18 本頁(yè)面
【正文】 %乙醇，氯仿和異戊醇（24：1），5 mol/L KAc，TE（10mmol/L TrisCl，1mmol/L EDTA，H2O），RNaseA，ddH2O，10PCR buffer，25 mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs，Taq酶（PCR擴(kuò)增試劑均購(gòu)自上海生工），GoldView（購(gòu)自賽百盛），%瓊脂糖凝膠。 BioRad凝膠成像系統(tǒng)，Eppendorf PCR儀，水平電泳儀，20℃冰箱，制冰機(jī)，Thermo冷凍離心機(jī)，普通離心機(jī)，Unico UV2102C型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，滅菌鍋，研缽，離心管，冰盤(pán)。采用在CTAB法[6]以及王莉花等[7]提取方法基礎(chǔ)上改進(jìn)的SDS微量快速提取DNA。，再加入300μL DNA提取液充分研磨；，再向研缽中加入300μL DNA提取液并轉(zhuǎn)入同一離心管中；℃水浴1小時(shí)，并不時(shí)輕輕上下顛倒離心管； 5M KAc冰浴30分鐘，再向離心管中加入400μL氯仿/異戊醇（24：1），冰浴20min；℃下，4000rpm離心15min，取上清液并轉(zhuǎn)入另一滅菌的離心管中，上下輕輕顛倒；℃下，8000rpm離心4min，而后棄上清液；%乙醇漂洗沉淀12次，放入50℃烘箱干燥15min； TE溶解DNA，%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，測(cè)定OD260及OD280,確定DNA的純度及含量。置于20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?ITS序列引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank里已登陸的蕎麥ITS序列AB000325AB000329，AB000339，AB000340和Yasuo Yasui等[8]、White等[5]報(bào)道的引物序列，設(shè)計(jì)、選取出一對(duì)特異引物：Primer1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’Primer2: 5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’這對(duì)引物的擴(kuò)增區(qū)包含了ITS引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。 三份蕎麥ITS序列的PCR擴(kuò)增在趙暉等[9]報(bào)道的雪腐核盤(pán)菌ITS序列擴(kuò)增體系及循環(huán)程序基礎(chǔ)上，改進(jìn)反應(yīng)體系以及退火溫度和延伸時(shí)間。采用PCR總體積50μL，反應(yīng)體系如下：ddH2O μL10Buffer 5μL25mmol/L MgCl2 2μLdNTP mixture 1μL20umol/L Primer1 1μL20umol/L Primer2 1μL模板DNA 1μLTaq DNA聚合酶 （5U）總體積 50μL按照上述順序分別加入，反應(yīng)循環(huán)程序：}95℃ 3min30個(gè)循環(huán) 94℃ 30sec ℃ 1min72℃ 55sec72℃ 10min4℃ 保存 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)取5μL PCR產(chǎn)物與1μL 6Loading buffer混勻，%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序?qū)CR產(chǎn)物直接送上海英駿生物技術(shù)有限公司純化和測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)選取的一對(duì)引物均位于ITS序列以外（圖2），ITS1位于18s rDNA，ITS4位于26s rDNA[5]。因此直接采用下游引物進(jìn)行單向測(cè)序，另一條鏈則以互補(bǔ)配對(duì)原則得出序列。 圖2 ITS序列引物所在位置 ITS序列分析將三份蕎麥rDNA的ITS序列的測(cè)序結(jié)果與已登陸的蕎麥ITS序列（AB000325AB000329，AB000339，AB000340）比較，確定ITS1和ITS2的范圍。用生物信息學(xué)分析軟件DNASTAR 。 2結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)所提取的野生金蕎麥1號(hào)、野生金蕎麥2號(hào)和苦蕎總DNA經(jīng)Unico UV2102C型紫外可見(jiàn)分光光度檢測(cè)，三個(gè)樣品的OD260/OD280分別為：、。野生金蕎麥1號(hào)DNA有明顯的RNA的污染，可通過(guò)電泳圖分析，但已滿足PCR反應(yīng)對(duì)模板DNA純度的要求。%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3，條帶較為清晰，完整性較好，可以用于PCR反應(yīng)。15kb10Kb5kb1kbMarker 1 2 3 圖3 蕎麥總DNA電泳檢測(cè)；；以總DNA為模板，利用所設(shè)計(jì)的引物Primer1和Primer2（圖2 所示ITS1和ITS4） PCR擴(kuò)增出野生金蕎麥1號(hào)、2號(hào)和苦蕎ITS區(qū)的特異性條帶。野生金蕎麥1號(hào)、2號(hào)擴(kuò)增片段大小約700bp左右，苦蕎擴(kuò)增片段略小于700bp與Yasuo Yasui（1998）[8]報(bào)道的蕎麥屬I(mǎi)TS區(qū)序列長(zhǎng)度相近，結(jié)果見(jiàn)圖4。4500bp3000bp2000bp1200bp800bp500bp200bpMarker 1 2 3圖4 三份蕎麥ITS區(qū)PCR擴(kuò)增圖譜；；所獲得三份蕎麥ITS區(qū)序列由于測(cè)序的原因，在ITS1上游可能有14bp26bp處未能測(cè)出，ITS區(qū)全序列下游有55bp58bp在ITS區(qū)以外，測(cè)序結(jié)果如下。******************GAGAGACCCGCGTACCCGTTCTCAAACACCCCCGCGGGGCGCCTTCCCCGACCCCGGGAGAGATCCCGGGAGAGGAGGAGGTGTCCCGCGGTGCCTGTGGGGCAAGCTCTCCCGAAACGCCAAGTACGGTGGGGGGACCCTTCCCGGCTCCAACGAACCCCGGCGCGGACCGCGCCAAGGACCACGAACAGAGCCGCGTCCCGCCCCTCCCGGGCCCCGGGAGGGGCGGATACCTCACGTCGTTTCTAACAAACAGAACGACTCTCGGCAACTGATATCTCGGCTCTCACATCAATGAAAAACGTAACTAAATGCGATACTTGGAGTGAATTGCACAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGGCTTCGGCTGAGGGGACGCCTGTCTGGGCGTCACCCATCCCGTCTCCCCCTCTCCCTCCTCCGTTCCTCGGAAGGAGGCGGGCGGCTAGGGCCCGACAGTGGCCCCCCGTGCGTCGCCTCGCGGCCGACCTAAAGGCCGACCCCGTGGCCGCCAACGGCCGCTACAATTGATGGTGTACTGGACTACGCATCGCGTCGCGTCCCCGCGTGCCCCGGGAGCTCAACCCAGACAACCGGATAGCCACGGTCTTCAGAACCGA
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