《實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)》ppt課件-文庫吧
2025-04-14 00:24 本頁面
【正文】 細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。 培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定v 1．臺(tái)盼藍(lán)法v 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色；v 用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力；v 方法： 將細(xì)胞懸液以 ； 加入 %臺(tái)盼蘭染液，染色 2一 3分鐘； 吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片； 鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力； 死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。 活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。v 2．四唑鹽 （ MTT） 比色法v 四唑鹽 （ MTT） 商品名為噻唑藍(lán)；v MTT比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物 （ formazan)， 并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜 （ DMSO） 能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的 formazan量 成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定 OD值；v MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選 、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。v 操作步驟： （ 1）單細(xì)胞懸液接種于 96孔培養(yǎng)板； 103104細(xì)胞 /孔，每孔培養(yǎng)基總量 200微升（ 96孔培養(yǎng)板每孔容積 370微升）， 37℃ 、5％v CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間 （ 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）； （ 2）加入 2毫克／毫升的 MTT液（ 50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng) 3小時(shí)； ?。?3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入 DMSO液（ 150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩 10分鐘，使結(jié)晶物溶解； ?。?4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔 OD值（檢測(cè)波長 570納米）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇v 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融v 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。v 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序v 標(biāo)準(zhǔn)程序：v 當(dāng)溫度在 25℃ 以上時(shí)， 1～ 2℃ /minv 當(dāng)溫度達(dá) 25℃ 以下時(shí)， 5～ 10℃ /minv 當(dāng)溫度達(dá) 100℃ 時(shí)，可迅速放入液氮中v 簡易程序：v 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降 1～ 2℃ 的速度，在 40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停 30分鐘后，直接投入液氮中。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用v 在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。v 常用的低溫保護(hù)劑是 DMSO， 它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法v 1． 預(yù)先配制凍存液：含 20% 血清培養(yǎng)基， 10%DMSO ，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞； v 2． 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液 ,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（ 1106 ～ 5 106細(xì)胞 /ml)；v 3．加入 1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。細(xì)胞復(fù)蘇方法 （ 1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入 37～ 38 ℃ 水浴中，使其融化（ 1分鐘左右）； （ 2） 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上； ?。?3）低速離心 10分鐘； ?。?4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。免疫組化基本技術(shù)標(biāo)本的取材組織的固定 脫水、透明和包埋切片 一、組織與細(xì)胞材料的制備 手術(shù)切除標(biāo)本，各種活檢穿刺標(biāo)本
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