【正文】 MB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。 而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù) 1000—3000個(gè)！ 適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。 （ 2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 但有特殊用途 : 由 pSC101派生來的載體特點(diǎn)是分子量小，拷貝數(shù)低。 當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時(shí)會嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動，導(dǎo)致寄主菌死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。 pLG33 pLG33 pHSG415等 不適合大量擴(kuò)增 DNA用。 （ 3）失控的質(zhì)粒載體 這是一類 溫度敏感型復(fù)制控制 質(zhì)粒。 溫度低（低于 37 oC），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（ 40 oC）時(shí)，拷貝數(shù)會很快增加到 1000個(gè)以上。 如 pBEU pBEU2。 runaway plasmid vectors 1979年 B. E. Uhlin等構(gòu)建。 （ 4） 插入失活型質(zhì)粒載體 載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。 如 pDF4 pDF4 pBR329。 抗菌素抗性 外源 DNA 無抗菌素抗性 （ 5） 正選擇的質(zhì)粒載體 如 pUR pTR262等。 只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。 直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。 目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。 Direct selection vectors （ 6） 表達(dá)型質(zhì)粒載體 主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。 如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄 —翻譯信號控制之下。 注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。 復(fù)制起始點(diǎn) ORI、 選擇標(biāo)記、 多克隆位點(diǎn) MCS 2）大腸桿菌操縱子元件 阻遏基因 I 操縱基因 O 啟動基因 P 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（ SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。 1）普通載體元件 表達(dá)載體的 結(jié)構(gòu) A. pSC101 第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。 （ 1）類型 天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。 （ 2）長度 kb。 （ 3）選擇標(biāo)記 四環(huán)素抗性 Tetr 6個(gè)克隆位點(diǎn)： EcoR I、 Xho I、 Pvu I、 Hind III、BamH I、 Sal I 主要使用 EcoR I。 （其中 Hind III、 BamH I、 Sal I 3個(gè)位于選擇標(biāo)記 Tetr的內(nèi)部） （ 4）克隆位點(diǎn) B. ColE1 （ 1）類型 天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。 （ 2）長度 kb。 （ 3）選擇標(biāo)記 大腸桿菌素（ colicin） E1和對 E1免疫的基因（ immE1） 特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞 10003000拷貝之多！ ① colicin E1基因的結(jié)構(gòu) cea imm kil 結(jié)構(gòu)基因 免疫基因 溶菌基因 ② 殺死不含有 ColE1細(xì)菌的原因 cea + kil基因產(chǎn)物 ③ 不被其他細(xì)菌的 colicin E1所殺死的原因 imm基因 EcoR I位于 E1內(nèi)部，插入外源 DNA會導(dǎo)致 E1失活，使受體菌不能合成 E1（ ColE1），但仍然表現(xiàn)出對 E1免疫型（ ImmE1+）。 EcoR I （ 4）克隆位點(diǎn) Colicin E1 外源 DNA 無 Colicin 用對外源 colicin E1的免疫性和自身不能合成 colicin E1作選擇，操作非常繁雜。 對 colicin E1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗 colicin E1的頻率很高！ （ 5） ColE1的選擇缺陷 ColE1 抗 colicinE1 殺 ColE1 仍抗 colicinE1 不殺 ColE1 插入片斷 ColE1 pSP2124質(zhì)粒的 Ampr基因 C. pBR322： （ 1）元件來源 F. Bolivar和 . Rodriguez人工構(gòu)建載體。 ① 復(fù)制起點(diǎn) ori pMB1系列（來源于 ColE1）的 高拷貝 型復(fù)制起點(diǎn) ② Ampr基因 ③ Tetr基因 pSC101的 Tetr 基因。 （ 2）長度 4363bp （ 3）選擇標(biāo)記 氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。 （ 4）克隆位點(diǎn) 其中 9個(gè)會導(dǎo)致 Tetr基因失活（如BamH I、 Hind Ⅲ 、 Sal I）； 3個(gè)會導(dǎo)致 Ampr基因失活（ Sca I、PvuI、 Pst I）。 24個(gè)克隆位點(diǎn)。 （ 5） pBR322的優(yōu)點(diǎn) ① 雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記 插入失活，分兩次先后選擇： 沒有獲得載體的寄主細(xì)胞 ? 在 Amp或 Tet中 都 死亡。 獲得載體的寄主細(xì)胞 ? 在 Amp或 Tet其中之一 中死亡。 外源基因 ?BamH I Amp中存活 但在 Tet中死亡 外源基因 ?Pst I Tet中存活 但在 Amp中死亡 氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)1000~3000copy ④ 安全 失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因 mob（ mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 ③ 高拷貝數(shù) ② 分子小，克隆能力大 載體越小越好。 10kb的 DNA在純化過程中容易斷裂。 保留了轉(zhuǎn)移蛋白（ mob）的 作用位點(diǎn) 。 （ 6） pBR322的缺點(diǎn) 能夠被 ColK質(zhì)粒編碼的 mob蛋白識別，如果再有 F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！ ① 刪除 mob識別位點(diǎn) （如質(zhì)粒 pBR32 pAT153等）。 pAT153： 從 pBR322上切去 HaeII片斷，既除去了 mob識別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。 （ 7） PBR322的改進(jìn) pBR325： 在 pBR322位點(diǎn)上接入一段來自噬菌體 PICm的 HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因 cmlr）。 cmlr上也帶一個(gè) EcoRI位點(diǎn) 。 使 EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。 ② 改造 EcoR I 位點(diǎn) D. pUC系列 University of California的 J. Messing和 J. Vieria于 1978年，在 pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。 pUC pUC pUC pUCpUC1 pUC1 pUC19 ① 復(fù)制起點(diǎn) pBR322的 ori 但其上失去了克隆位點(diǎn)。 ② Ampr 基因 （ 1）元件來源 ③ lacZ的啟動子 大腸桿菌 ④ lacZ’基因 大腸桿菌 lacZ的 ?肽鏈序列， 是 LacZ 的氨基端片斷。 pBR322的 Ampr基因 （ 2）長度 約 （ 3）克隆位點(diǎn) 10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于 lacZ’基因的 5’端。 pUC18/19 Ampicillin 抗性 和 lacZ的 ?肽互補(bǔ) （藍(lán)白斑）相結(jié)合。 （ 4）選擇標(biāo)記 藍(lán)白斑選擇原理： ① Xgal （ 5Bromo4chloro3indolyl?Dgalactoside） ?半乳糖苷酶 能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個(gè) 深藍(lán)色 的物質(zhì) 5溴 4氯靛藍(lán)。 Xgal 半乳糖 5溴 4氯靛藍(lán) ?半乳糖苷酶 ② ?半乳糖苷酶 Xgal顯色反應(yīng) ： ③ lacZ的 ?肽互補(bǔ) 1） ?肽（ lacZ’ ）： ?半乳糖苷酶 N端的一段氨基酸片斷（ 1141氨基酸）。 lacZ只有在 4聚體的狀態(tài)下才有功能 . C端大部分 N端的 1141aa C端大部分 N端的 1141aa C端大部分 N端的 1141aa C端大部分 N端的 1141aa 4聚體 2）受體菌 lacZ突變（ lacZ?M15） 受體菌基因組的 ?半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失 ?肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解 Xgal 受體菌株： JM系列 、 TG TGXL1blue、 XS12 XS10 KK218MV118 DH5a pUC質(zhì)粒載體上的 lacZ’ 編碼 ?肽與這個(gè)缺失突變的 ?半乳糖苷酶 “ 互補(bǔ) ” ，使它能形成 4聚體。又能分解 Xgal。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。 C端大部分 N端的 1141aa pUC lacZ’ 受體菌 lacZ? 3）載體 lacZ’與 ?互補(bǔ) 4） ?互補(bǔ)的插入失活 pUC載體上 LacZ’的 5‘端有一段多克隆位點(diǎn) (MCS)區(qū)，本身雖不干擾 LacZ’的合成，但插入外源基因就會阻止 LacZ’的