【正文】 （ 15） （ 16） ④ 培養(yǎng)基的配制方法（藥品室進(jìn)行） MS++NAA1+Su3%+% 500 mL ? 水 +母液 ： ? 激素或其他成分 ：如活性碳等 ? 糖類 ：一般 30g/L ? 瓊脂 ：一般 6－ 8g/L ? 加熱溶化 ： ? pH值調(diào)整 ： ? 定容 ： ? 分注、封口 ： ? 滅菌 ： 培養(yǎng)基 的配制 滅菌 ① 濕熱滅菌： 培養(yǎng)基及布制品的滅菌 ? 幾種排氣的方法： ? 時間與體積的關(guān)系： ? 放氣方法： 容器的體積 /mL 在 121℃ 滅菌所需最少時間 /min 2050 15 75150 20 250500 25 1000 30 植物組織培養(yǎng)的步驟 ② 灼燒滅菌 ：用于無菌操作的器械 95%的酒精 +酒精燈火焰上灼燒 接種器殺菌器：如圖 ③過濾滅菌 ：不耐熱的物質(zhì) 滅菌 ④ 干熱滅菌 ：玻璃器皿及耐熱用具等 ⑤ 紫外線和熏蒸滅菌 ：空間滅菌所用（培養(yǎng)室、接種室等） ⑥ 一些物體表面用藥劑噴霧滅菌 滅菌 ⑦ 消毒劑表面滅菌 ：植物材料 （超凈工作臺上，接種室） 消毒劑因素 材料采集的因素 老嫩因素 部位因素 天氣因素 季節(jié)因素 時間因素 外植體消毒步驟 滅菌 消毒劑因素 消毒劑 使用濃度 去除難易 消毒時間（分） 效 果 次氯酸鈣 9％－ 10％ 易 5－ 30 很好 次氯酸鈉 2％ 易 5－ 30 很好 過氧化氫 10％－ 12％ 最易 5－ 15 好 溴 水 1％－ 2％ 易 2－ 10 很好 硝酸銀 1％ 較難 5－ 30 好 氯化汞 ％－ 1％ 較難 2－ 25 最好 抗生素 4－ 50mg/L 中 30－ 60 較好 酒 精 70％－ 75％ 易 數(shù)秒－ 5分 好 漂白粉 飽 和 易 5－ 30 很好 滅菌 外植體消毒步驟 ? 材料 → 自來水 → 蒸餾水 → 75%酒精 30~60 S 無菌水 3~4次 → 10%次氯酸鈉或次氯酸鈣飽和液或~%升汞 （吐溫） 5~15 min → 無菌水洗5~8次。 滅菌 ２ . 接種（接種室） 植物組織培養(yǎng)的步驟 培養(yǎng) Culture（培養(yǎng)室） ? 培養(yǎng)方法 固體培養(yǎng)法 液體培養(yǎng)法 ? 培養(yǎng)步驟 初代培養(yǎng) ：愈傷組織；原球莖；頂芽和腋芽的發(fā)育 ；不定芽的發(fā)育 ；體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育 ；初代培養(yǎng)外植體的褐變 繼代培養(yǎng)：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等 生根培養(yǎng) : 植物組織培養(yǎng)的步驟 ? 培養(yǎng)條件 ： 環(huán)境培養(yǎng)條件：溫度（ Light) 、濕度（ Humidity) 、光照［光質(zhì)（ Light wave)、光強（ Light intensity)、光周期（ Light period)］ 化學(xué)環(huán)境條件 ：滲透壓（ Perating pressure) 、 ｐＨ、氣體（ Gas) 培養(yǎng) 試管苗馴化移栽 ① 試管苗與大田苗在生理、形態(tài)等方面的差異 ② 異養(yǎng)型 自養(yǎng)型 ③ 無菌 有菌 ④ 管理： ? 保持小苗的水分供需平衡。 ?防止菌類滋生。 ?一定的溫、光條件。 ?保持基質(zhì)適當(dāng)?shù)耐庑浴? 植物組織培養(yǎng)的步驟 試管苗增殖率的估算 ① 基本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計 ?每一周期（從接種當(dāng)天到再次可供接種的當(dāng)天）需要多少天 ?每一周期每一瓶能接種多少瓶 ?每瓶有多少苗 ① 基本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計每一周期（從接種當(dāng)天到再次可供接種的當(dāng)天）需要多少天每一周期每一瓶能接種多少瓶每瓶有多少苗 植物組織培養(yǎng)的步驟 ② 計算出年增殖率的理論值 年增殖率： Y；每周期增殖的倍數(shù)： X； 全年可增殖的周期數(shù)： n=365/每一周期的天數(shù)； Y=Xn 試管苗增殖率的估算 仙茅（石蒜科） 葡萄（葡萄科） 茶樹（山茶科） 麻瘋樹（大戟科） 油樟（樟科） 生姜（姜科） 蘭草（蘭科） 蘆薈 蘭 草 麻瘋樹 移 栽 快速繁殖工作的計劃安排 ?人工的配置安排 ?實驗啟動的時間安排 ?增殖瓶數(shù)的控制 ?污染的估測 植物組織培養(yǎng)的步驟 植物主要的組織培養(yǎng)技術(shù) 植物脫毒與快繁技術(shù) 花藥及花粉培養(yǎng) 植物胚胎培養(yǎng) 植物組 織培養(yǎng) 植物脫毒與快繁技術(shù) 植物主要的 組織培養(yǎng)技術(shù) ① 意義 快速繁殖，保持優(yōu)良品質(zhì) 生產(chǎn)無毒苗，提高苗木品質(zhì) 節(jié)約土地 ?快速繁殖： 一片樹葉能變一座森林 一年內(nèi)可從一個蘭花莖尖繁殖出 400萬株遺傳性狀均一的健康植株； 花葉芋：常規(guī)繁殖：幾倍 —— 幾十倍 組培繁殖：幾萬 —— 數(shù)百萬倍 月季、菊花、牡丹、山茶等。 ?脫毒花卉：去病毒后，植株生長勢強，花朵變大，色澤鮮艷 ，抗逆能力提高，產(chǎn)花數(shù)量上升。預(yù)計在 21世紀(jì)，這一技術(shù)的應(yīng)用將更為廣泛。如：蘭花、大麗花、水仙、天竺葵菊花等。 脫毒馬鈴薯：增產(chǎn) 40200%(20222500kg/畝 )。 紅薯：增產(chǎn) 30%以上。 草莓：增產(chǎn) 5001000千克 /畝 植物脫毒與快繁技術(shù) 植物脫毒與快繁技術(shù) ② 植物脫毒技術(shù) 為什么植物需要脫毒 ? 脫毒方式： ? 熱處理脫毒 → 病毒鈍化 (寄主植物很少或不會受到傷害 ) 溫湯浸漬處理： 在 50℃ 左右的溫水中浸漬 10分鐘至數(shù)小時。缺點：易使材料受傷。 熱空氣處理： 3540℃ ，幾十分鐘，長可達(dá)數(shù)月溫?zé)嶂委熓遥ㄏ洌﹥?nèi) 。缺點：缺陷是并非能脫除所有病毒 熱處理需與其他方法配合應(yīng)用才可獲得良好的效果。 生長點（約 ）幾乎不含或含病毒很少 . 分生區(qū)域內(nèi)無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不 上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生長速度。 ?莖尖培養(yǎng)脫毒 植物脫毒與快繁技術(shù) ? 其他途徑脫毒 愈傷組織培養(yǎng)脫毒 僅有部分單個細(xì)胞含有病毒 —— 病毒的復(fù)制速度趕不上細(xì)胞的增殖速度或有些細(xì)胞通過突變獲得了抗病毒的抗性。缺陷 —— 植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會產(chǎn)生變異植株，并且一些作物的愈傷組織尚不能產(chǎn)生再生植株。 化學(xué)療法脫毒 許多化學(xué)藥品（包括嘌呤、嘧啶類似物、氨基酸、抗菌素等）對離體組織和原生質(zhì)體具有脫毒效果。 植物脫毒與快繁技術(shù) ③ 脫毒效果檢測 ? 抗血清 (antiserum)鑒定 ：已知植物病毒 —— 核蛋白（抗原）制備抗體；抗血清 +未知的病毒植物 → 可見的沉淀（試管） ? 酶聯(lián)免疫吸收鑒定（ ELISA） ：已知植物病毒（抗原）+一抗（已制備） —— 二抗（酶） —— 酶的顯色底物溶液 —— 酶標(biāo)儀檢測 ? 電子顯微鏡（ electric microscope)檢查法 ：直接觀察病毒 的有無或種類 ? 指示植物 法 (indicating plant) ： 被鑒定植物 的汁液接種指示植物或嫁接接種法 （指示植物作為砧木，被鑒定植物作接穗 ） 指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的專化性癥狀的寄主植物。 植物脫毒與快繁技術(shù) 花藥及花粉培養(yǎng) ① 概念與意義 ? 花藥培養(yǎng)：花藥培養(yǎng)是把花粉發(fā)育到一定階段的花藥接種到培養(yǎng)基上，來改變花粉的發(fā)育程序，使其分裂形成細(xì)胞團，進(jìn)而分化成胚狀體，產(chǎn)生再生植株，或形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株。屬器官培養(yǎng)還是細(xì)胞培養(yǎng) ？ ? 花粉培養(yǎng)：花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。由于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的植株都是單倍體植株。 優(yōu)點：不受花藥的藥隔，藥壁、花絲等體細(xì)胞的干擾；缺點是較比花粉培養(yǎng)難度大。 屬器官培養(yǎng)還是細(xì)胞培養(yǎng) ？為何更多的要花藥培養(yǎng) ? (藥壁 提供營養(yǎng) ) 共同的目的：花粉細(xì)胞 → 單倍體 (haploid)細(xì)胞 → 單倍體植株（但不是最終目的但具應(yīng)用潛力， 為什么？ ） → 經(jīng)染色體加倍 → 正常結(jié)實 二倍體植株 。 植物主要的 組織培養(yǎng)技術(shù) 花藥及花粉培養(yǎng) ? 單倍體植物三個明顯的特點： 體細(xì)胞染色體數(shù)減半； 生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減小； 雌雄配子嚴(yán)重敗育，有的甚至不能進(jìn)入有性世代。 ? 單倍體的應(yīng)用潛力： 迅速獲得純合型材料，縮短育種年限 獲得育種中間材料 與誘變育種相結(jié)合可以提高誘變頻率 與細(xì)胞融合相結(jié)合，使這一育種途徑更具有實際應(yīng)用意義 作為遺傳工程受體更為有效（當(dāng)代表達(dá)） 用作基礎(chǔ)遺傳研究的各個領(lǐng)域 ? 加倍后的二倍體特點： 屬于真正的純系。和常規(guī)多代自交純化方法相比，可節(jié)省大量的時間和勞力。 花藥及 花粉培養(yǎng) 花藥及 花粉培養(yǎng) ② 花藥培養(yǎng)的基本程序是： 外植體選擇－ 外植體 (花蕾 )預(yù)處理 — 外植體消毒 — 剝?nèi)』ㄋ?— 接種 — 誘導(dǎo)培養(yǎng) — 分化培養(yǎng) ? 花藥培養(yǎng)前給予一定的低溫處理是十分必要的。 煙草、茄子 3～ 5℃ 72小時 水稻 10℃ 10～ 14天 柑橘 3℃ 5～ 10天 馬鈴薯 4℃ 48小時 ? 低溫處理的作用 ： 可以激發(fā)花粉母細(xì)胞產(chǎn)生兩個相等核 :一個營養(yǎng)核一個生 殖核； 保持高比例的強生活力花粉，同時延緩體細(xì)胞組織的衰老； 激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚； 促使細(xì)胞同步分裂。 花藥及 花粉培養(yǎng) ③ 花藥培養(yǎng)中單倍體形成的途徑 ? 營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑 : 生殖核退化 ,營養(yǎng)核發(fā)育