【正文】 溶劑萃取，動態(tài)頂空萃取 (DHS)，固相微萃取以及氣體傳感器等萃取方法研究單花蜜中的揮發(fā)性物質(zhì)成分 ，將揮發(fā)性物質(zhì)作為分類單花蜂蜜的特征標(biāo)記，是目前研究的熱門課題之一 [7]。 Bianchi F 等用動態(tài)頂空萃取樣品， GCMS 法測定分離出草莓蜜中的 28 個芳香化合物，其中 α 異佛爾酮， β 異佛爾酮和酮代異佛爾酮被認(rèn)為是草莓蜜的特征標(biāo)記 [8]。動態(tài)頂空萃取法是花粉分析的有效替代方法，尤其用于處理如草莓蜜這種花粉含量少的蜂蜜樣品。 課題研究內(nèi)容 研究背景 我國是世界養(yǎng)蜂大國，由于我國國土遼闊、地理氣候優(yōu)越以及蜜源植物豐富，不僅蜂蜜產(chǎn)量居世界首位 ( 年產(chǎn)約 20萬噸 ) ，而且蜂蜜品種種類和數(shù) 量繁多，分布廣泛。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國能被蜜蜂利用的蜜源植物約 5000種以上，能取到商品蜜的蜜源植物有 100多種 [6]。根據(jù)國際食品法典委員會蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)、歐盟蜂蜜指令及其他相關(guān)規(guī)定，蜂蜜種類 依據(jù)來源、生產(chǎn)方式或外觀劃分 [1516]。最常見的劃分是 依據(jù) 蜜蜂所采集的蜜源植物種類而分的，主要蜜源是單一植物的稱作單花種蜂蜜，采自多種植物的為雜花蜜或百花蜜。不同蜜源植物來源的蜂蜜的成分主要取決于植物類型、植物花期、氣候、蜂群強弱以及取蜜時間等，不僅在感官和內(nèi)在品質(zhì)上有一定的差異，而且其營養(yǎng)效果也有所不同 [6]。 研究內(nèi)容 以康思農(nóng)油菜花蜜為實驗對象分別固定氯化鈉的量、萃取時間、萃取溫度，采取平行實驗，得出最優(yōu)的萃取條件，再以最優(yōu)條件對其他九種樣品進(jìn)行實驗，得到在不同條件下的 9種氣相色譜圖以及不同品牌油菜花蜂蜜下的 9種氣相色譜圖，并由此建立油菜花蜂蜜中揮發(fā)性成分的特征圖譜。 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 3 2 實驗部分 實驗樣品 樣品均為 淘寶、京東 銷售的產(chǎn)自 全國 的不同品牌的 油菜花蜜。 表 1 不同品牌蜂蜜樣品 實驗試劑 蒸餾水（實驗室自制）， NaCl（分析純）。 實驗 器材 表 2 主要實驗器材 主要設(shè)備 廠家 852 型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司 鶴壽一次性無菌注射器 常州悅康醫(yī)療器材有限公司 EL2022 電子天平 梅特勒 托利多儀器（上海）有限公司 57328U 型 PDMS 萃取頭 SUPELCO GC2022C A T F 日本島津有限公司 CBM102 GCsolution 工作站 日本島津有限公司 蜂蜜品牌 產(chǎn)地 生產(chǎn)日期 編號 暖民 四川成都 2022 年 02 月 10 日 Y1 雷允上 浙江寧波 2022 年 02 月 25 日 Y2 康思農(nóng) 湖北武漢 2022 年 07 月 27 日 Y3 蜂獻(xiàn) 安徽安慶 2022 年 12 月 11 日 Y4 葆豐 重慶渝北 2022 年 02 月 09 日 Y5 劉氏 安徽安慶 2022 年 01 月 29 日 Y6 越貢 浙江紹興 2022 年 01 月 13 日 Y7 丁氏 云南昆明 2022 年 02 月 17 日 Y8 精靈子 重慶云陽 2022 年 01 月 21 日 Y9 藏原蜜語 青海西寧 2022 年 10 月 16 日 Y10 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 4 實驗方法 以油菜花蜜為實驗對象，對別于市場購買 10種不同商家的油菜花蜜?？偣矞y定 10個樣品的特征性圖譜，分 3階段經(jīng)行，第一階段是優(yōu)化 條件，以一種蜂蜜為實驗對象，利用頂空固相微萃取技術(shù)，改變萃取條件已達(dá)到最優(yōu)數(shù)據(jù)，其中萃取條件主要是 NaCl的量，萃取溫度，萃取時間 3個因素，其中 NaCl為 0g， ， ， 。萃取溫度為 30℃， 40℃， 50℃，60℃。萃取的時間為 20min， 25min， 30min， 40min。第二階段為用優(yōu)化條件針對剩下的 9組樣品進(jìn)行分析，這里每組樣品只需一組最優(yōu)數(shù)據(jù)。第三階段是整合分析實驗數(shù)據(jù)，最后得到在不同條件下以及不同品牌蜂蜜下油菜花蜜的氣相色譜圖，并由此建立油菜花蜜中的揮發(fā)性成分特征圖譜 [17]。 頂空固相微萃取提取油菜花蜜揮發(fā)性成分方法 準(zhǔn)確稱取 蜂蜜樣品，加入容量瓶中；加入 1ml 的蒸餾水；加入氯化鈉，加入轉(zhuǎn)子，旋緊蓋子；用 250ml 的燒杯加入適量的水，放在磁力攪拌器上加熱，作為恒溫水??；用溫度計測量水溫，待水浴溫度恒定后，將 PDMS 萃取頭插入容量瓶至適當(dāng)位置，再將容量瓶放入恒溫水浴中，并用試管架固定好萃取器；調(diào)試磁力攪拌器的轉(zhuǎn)動速度，使得轉(zhuǎn)子穩(wěn)定轉(zhuǎn)動即可，伸出萃取頭，開始揮發(fā)性成分的采集，并記時；采集完成后，收起萃取頭，最后將提取好的萃取器插入氣相色譜儀中進(jìn)行分析。 氣相色譜儀的操作流程 開機(jī)： ? 先開氮氣閥門，開電腦，打開工作站，打開儀器開關(guān)，打開信號采集器，順時針打開尾吹 氫氣和 空氣旋紐。 ? 控制面板打開程序文件。點擊 System, 打開 GC。工作站點擊“采集參數(shù)”，“單次分析”，“樣品記錄”，設(shè)置數(shù)據(jù)存儲路徑。 ? 等進(jìn)樣口、色譜柱、檢測器 3 個地方溫度升到設(shè)定溫度，打開 氫氣和 空氣鋼瓶閥門，控制面板上 DET，按“點火”鍵。 ? 進(jìn)樣，同時按下綠色按紐“ START”，同時點擊工作站“開始”和按下信號采集器的通道鍵，直到采集完成。 關(guān)機(jī)： ? 先關(guān)尾吹 氫氣和 空氣旋紐，逆時針旋轉(zhuǎn)。 ? 點 擊 SYSTEM，關(guān)閉 GC。等進(jìn)樣口、色譜柱、檢測器 3 個地方溫度低于 100 度時，關(guān)儀器電源，關(guān)氮氣閥門。 ? 關(guān)工作站，關(guān)電腦，關(guān)信號采集器。 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 5 色譜柱凈化：再較長時間不使用氣相色譜儀之后，下一次使用需進(jìn)行 260 度凈化 15 分鐘（基線不平則繼續(xù)升溫凈化）。 氣相色譜條件 氣 相色譜儀（日本島津 GC2022C） ，配有 FID 氫火焰離子檢測器、美國 Restek 毛細(xì)管柱 (30m ， m) ， 進(jìn)樣口為雙填充 INJ+ ，以及 TCD 熱導(dǎo)檢測器 [15]。 對色譜分析中的分離溫度進(jìn)行了優(yōu)化。為縮短蜂 蜜中各揮發(fā)性組分的保留時間，提高分離度，同時降低峰寬，選擇程序升溫體系。兼顧分離效果和色譜峰形，選擇的最佳升溫梯度為：初始化溫度為 50℃ 保持 3min；第一階段以 5℃ /min 的升溫速度升至 200℃ ，并保持 5min；第二階段以 8℃ /min 的速度升溫至 240℃ ，并保持 15min，平衡時間為 3min[16]。 進(jìn)樣口的溫度設(shè)定為 250℃ ，檢測器的溫度為 260℃ ，載氣為 % 高純度氮氣，載氣流速是 ，采樣時間為 5min。 較適條件下?lián)]發(fā)性成分的提取和氣相色譜圖的獲得 在萃取頭已經(jīng)提取 了揮發(fā)性成分之后，將萃取頭插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口中，開始進(jìn)樣，萃取頭在采集 30min 之后取出，取出后的萃取頭繼續(xù)進(jìn)行下一樣品揮發(fā)性成分的提取。氣相色譜的具體操作可以參照 ，等工作站走完整個流程，得出氣相色譜圖，并且標(biāo)識上蜂蜜樣品的信息，便于 10 種蜂蜜的區(qū)分。 色譜圖的數(shù)字化 實驗過程中的數(shù)據(jù)分析過程，是為了對蜂蜜樣品色譜圖進(jìn)行比較，然而單純的通過肉眼來觀察分析，是很難精確的分析出共有峰以及得到準(zhǔn)確的特征圖譜的 [18]。所以就必須將這些色譜圖進(jìn)行數(shù)字化，由此得到每個樣品圖譜的數(shù)字化信息數(shù)據(jù)， 得到的數(shù)字化信息就能夠用計算機(jī)進(jìn)行分析比較，并將比較的結(jié)果進(jìn)行量化表述，這樣來獲得不同蜂蜜樣品的共有峰，從而獲得油菜花蜂蜜的特征圖譜 [18]。 從一張色譜圖中可以的獲得三個主要信息：一是保留值（即為氣相色譜圖的保留時間）；二是峰強度（即是色譜圖的峰面積或峰高）；三是半峰寬，由此可以判斷色譜分離時的柱效 [18]。在這樣的三個信息中，保留值和峰強度是判斷識別和鑒定油菜花蜂蜜樣品揮發(fā)性氣體中復(fù)雜組分的主要依據(jù)，是本論文數(shù)據(jù)分析的重要數(shù)據(jù)源，將樣品色譜圖中的保留值和峰強度進(jìn)行數(shù)字化，之后得到的稱之為色譜特征譜 。 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 6 數(shù)據(jù)處理方法 采用 進(jìn)行 萃取條件優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)分析， 采用 Excel 2022 軟件對 10 種油菜花蜂蜜樣品的 內(nèi)參考峰的獲取、相對保留值、共有峰保留時間等數(shù)據(jù)進(jìn)行處理 [18]。 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 7 3 結(jié)果和討論 本論文研究中將保留值和峰強度進(jìn)行數(shù)字化的最簡單的方法，就是直接用氣相色譜的保留時間的數(shù)值來表示保留值，用峰高或峰面積來表示峰強度 [18]。但是，用這種數(shù)字化方法得到的數(shù)字化色譜特征譜，由于色譜本身存在著很大的缺陷而無法使用，這一缺陷就是色譜的保留值受到很多因素的影響。就是將色譜 條件，如柱溫、流動相的流速、流動相的組成，進(jìn)樣量等等進(jìn)行嚴(yán)格控制，但它們的一些微小變化也會影響保留值的變化，更何況一些無法控制的因素的變化，如柱料填充狀況的變化、室溫的變化、流動相中易揮發(fā)成分的揮發(fā)等等，都將使色譜保留值發(fā)生變化 [18]。所以直接用保留值進(jìn)行比較，將會產(chǎn)生很多錯誤，直接用保留值的數(shù)值進(jìn)行數(shù)字化得到的色譜特征圖也是無法使用的。 本論文研究中為了解決色譜保留值易受到很多因素的影響而發(fā)生波動，無法進(jìn)行比較的缺陷，查閱文獻(xiàn)借鑒并引入了“相對保留值 （ relative retention volume） ”的概念 [18]。文獻(xiàn)中對“相對保留值”的定義：組分圖參與組分的調(diào)整保留值之比。相對保留值可以消除各種因素對色譜保留值的影響，既便色譜保留值色譜保留值發(fā)生了波動，“相對保留值”也是不會隨其發(fā)生波動，其數(shù)值是穩(wěn)定的 [18]。因此，用相對保留值的數(shù)值對色譜圖進(jìn)行數(shù)字化得到的不同樣品色譜特征譜之間就可以相互比較了，以便于取尋找共有峰。由此可以看出，要將色譜特征圖譜數(shù)字化而得到可以進(jìn)行比較的數(shù)字化色譜特征譜的關(guān)鍵是在色譜圖中如何選擇或者插入一個合適的參考峰 [18]。 萃取條件的優(yōu)化 本研究對萃取溫度、萃取時 間、氯化鈉的添加量這三個條件進(jìn)行了實驗：萃取溫度的選擇分為四個梯度，分別為 30℃、 40℃、 50℃、和 60℃；萃取時間的選擇分為四個梯度，分別為 20min、 25min、 30min 和 40min；萃取氯化鈉的添加量分為下面四種 0g、 、 、。 表 3 萃取條件優(yōu)化結(jié)果 時間（ min） 峰個數(shù) 最大峰高（μV） * 溫度梯度（ ℃ ） 峰個數(shù) 最大峰高（μV） * Nacl 添加量（ g） 峰個數(shù) 最大峰高（μV） * 20 24 35548 30 21 51129 0 35 44961 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 8 25 31 39312 40 37 67495 31 41984 30 39 67495 50 31 36763 37 67495 40 31 29400 60 12 20765 33 52314 *峰高大于 1000μ V 計入峰個數(shù) 圖 1（ a） 萃取時間對峰數(shù)的影響 圖 1（ b） 萃取時間對最大峰強度的影響 由圖 1 可知道在萃取時間為 30min 時峰個數(shù)最多，最大峰 強度 最大，則表明 30min 為最適萃取時間，與文獻(xiàn) [17]結(jié)果相同。 圖 2（ a） 萃取溫度對峰數(shù)的影響 圖 2（ b） 萃取溫度對最大峰強度的影響 由圖 2 可知道在萃取溫度為 40℃時峰個數(shù)最多和最大峰 強度 最大，則表明 40℃的萃取溫度為最適合的，與文獻(xiàn) [17]結(jié)果相同。 圖 3（ a） 萃取氯化鈉量對峰數(shù)的影響 圖 3（ b） 萃取氯化鈉量對最大峰強度的影響 常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 9 由圖 3 可知當(dāng)氯化鈉的添加量為 時，峰個數(shù)最多，最大峰 強度 最大，則說明 為最佳添加量，與文獻(xiàn) [17]結(jié)果相同。 共有內(nèi)參考峰的確定 參考峰的選擇：參考峰的選擇時要根據(jù)復(fù)雜樣品的實際分離情況和實驗條件的可能性來決定是采用外插參考峰還是內(nèi)參考峰 [18]。外 插參考峰用于成分的鑒定試驗，而且本論文油菜蜂蜜揮發(fā)性成分較多，選擇合適的內(nèi)標(biāo)物（內(nèi)標(biāo)物的色譜峰在進(jìn)行色譜分離時能夠與待鑒定的色譜峰很好的分離、出現(xiàn)的位置要居中，并且能較清晰的分辨出）難度較大 [18]。 在本論文中，通過觀察萃取條件優(yōu)化實驗色譜圖和油菜蜂蜜揮發(fā)性成分氣相色譜圖，可以簡單的分析出峰的數(shù)量一般在 30 多個，而且峰較多集中在前 30 分鐘，這樣的色譜圖峰較為密集，幾乎無縫可插，這時想在其中插入一個外參考峰幾乎是不可能的。此時，在10 組油菜蜂蜜揮發(fā)性成分色譜圖統(tǒng)一選擇一個適當(dāng)?shù)姆?，作為?nèi)參考峰，將保留值轉(zhuǎn)換 為相對保留值 [18]。內(nèi)參考峰必須符合以下條件 [18]： ① 內(nèi)參考峰必須與相鄰的的色譜峰分離較為良好，達(dá)到基線分離； ② 內(nèi)參考峰的峰位置應(yīng)位于所有色譜峰的中間，位于居中； ③ 內(nèi)參考峰應(yīng)是一個較強的色譜峰； ④ 內(nèi)參考峰應(yīng)在 10 種不同樣品的色譜圖中都存在。 在工作站得到樣品 Y1Y10 揮發(fā)性成分的氣相色譜圖，肉眼觀察很難區(qū)分差別，所以本研究中需要數(shù)字化的圖譜信息，并作出篩選。論文中將篩選條件定為如下的條件：半峰寬為 3 秒，斜略為 V/min，漂移為