《生物技術(shù)制藥》ppt課件 (2)-文庫吧
2024-12-24 04:55 本頁面
【正文】 外免疫法 ? 體外免疫法：用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況下，如制備人源性單克隆抗體，或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時(shí)使用。 ? 體外免疫法所需要的抗原量少，一般只需幾個(gè) ?g，免疫期短，僅 4~5天，干擾因素少，已成功制備出針對多種抗原的單克隆抗體，但融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株不夠穩(wěn)定。其基本方法是用 4~8周齡 BALB/c小鼠的脾臟制成單個(gè)細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá) ~5 ?g/ml， 在 5%CO37℃ 下培養(yǎng) 4~5天，再分離脾臟細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 1）細(xì)胞融合基本方法：取適量脾細(xì)胞（ 1 108）與骨髓瘤細(xì)胞（ 2 107 ~3 107）進(jìn)行混合，在聚乙二醇（ PEG） 作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時(shí)間控制在 2min以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將 PEG融合液緩慢稀釋。 ? （ 2）用于融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備條件：融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定等特點(diǎn)。書中表 41列舉了主要的骨髓瘤細(xì)胞系，其中 SP2/0、 ，細(xì)胞融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞只分泌均一的、完全來自脾細(xì)胞的抗體分子，它們是目前較為理想的可供融合的骨髓瘤細(xì)胞。特別是 SP2/0細(xì)胞系還具有容易培養(yǎng)、融合率高等特點(diǎn)，被國內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 3）誘導(dǎo)劑 PEG的影響： PEG分子量以及濃度越大，促融率越高。但其粘度和對細(xì)胞的毒性也隨之增大。目前常用的 PEG的濃度為 40%~50%，相對分子質(zhì)量以 4000為佳。但相對分子量400~6000，濃度在 10%~50%范圍之間的 PEG都能使細(xì)胞融合。為了提高融合率，在 PEG溶液中加入二甲基亞砜 (DMSO）， 以提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。但是， PEG和 DMSO都對細(xì)胞有毒性，必須嚴(yán)格限制它們和細(xì)胞的接觸時(shí)間，可通過低速離心 5min使細(xì)胞接觸更為緊密，然后用新配制的培養(yǎng)液來稀釋藥物并洗滌細(xì)胞。 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 4）培養(yǎng)基的正確選擇：常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是次黃嘌呤（ H）、 氨基喋呤（ A） 和胸腺嘧啶（ T） 配制的。其中氨基喋呤（ A） 能阻斷 DNA合成的主要途徑，瘤 瘤融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞因不能合成 DNA而死亡。脾 脾融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞在這樣的條件下，幾天內(nèi)亦迅速死亡。由于 SP2/0等骨髓瘤細(xì)胞都是次黃嘌呤（ H） 鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT） 缺乏株，脾細(xì)胞中卻有這種酶，因此脾 瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用 HGPRT酶，用次黃嘌呤（ H） 和胸腺嘧啶（ T） 合成 DNA， 使雜交瘤細(xì)胞得以生長 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 5）選擇性培養(yǎng)方法：通常將融合的細(xì)胞懸浮于 HAT的培養(yǎng)液（配方見書中表 42），加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔板內(nèi)，根據(jù)情況每 2~3天換液一次。換液時(shí)吸去 1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。在融合后 7天內(nèi)用 HAT培養(yǎng)液，殺死瘤 瘤融合細(xì)胞后，第 7~14天改用 HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的 RPMI1640 完全培養(yǎng)液（配方書中表 43），從融合后 8~9天就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測，篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 6）飼養(yǎng)細(xì)胞： ? 由于在最適的條件下大約有 105個(gè)脾細(xì)胞才能形成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，大量瘤細(xì)胞在 HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個(gè)或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不能存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。 ? 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。一般認(rèn)為飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞，故應(yīng)用的較多。 三、篩選陽性克隆與克隆化 ? （ 1）篩選陽性克隆： ? 因?yàn)楫a(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5%左右，所以要進(jìn)行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作，以選擇出陽性克隆，然后進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。 ? 為了盡快地篩選出陽性克隆，必須采用微量、快速、特異、敏感、簡便并一次能檢測大批標(biāo)本的方法。常用的檢測方法有免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)等。一般來說，免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)均適用于可溶性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測。免疫熒光技術(shù)適用于細(xì)胞抗原的抗體檢測，特別是制備以檢測患者活檢組織標(biāo)本為目的的抗體時(shí)，免疫熒光法更有意義，在篩選抗體的同時(shí)，還能對所識別的抗原進(jìn)行定位判定。 精制破傷風(fēng)毒素抗原（ ）吸附 （約 10?g/ml， 4℃ ， 3h） 洗滌 加雜交瘤培養(yǎng)上清液（ ） （ 4℃ ， 1h） 加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體（ ） （ 4℃ ， 1h）
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