【正文】 細(xì)胞分裂素） ——脂磷壁酸 (Lipoteichoic)，一種來(lái)源于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的熱原 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 32 ? 內(nèi)源性熱原 – 細(xì)胞分裂素： IL1, IL2, IL6, IL8 – 產(chǎn)生細(xì)胞分裂素的物質(zhì)： 外單核細(xì)胞及嗜中性細(xì)胞 固定組織巨嗜細(xì)胞 胞狀和腹膜巨嗜細(xì)胞 – 發(fā)熱機(jī)理：細(xì)胞分裂素刺激前下丘腦 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 33 熱原的主要檢查方法 ? 體內(nèi)熱原檢查法 ——兔溫法 (PT)是一種體內(nèi)的、全熱原的檢查方法。 ? 1942年 USP 12版第一次收載該法。 ? 各國(guó)藥典至今仍然使用該法。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 34 體外熱原檢查法（ IPT） ? 是一種體外的利用人血細(xì)胞反應(yīng)的外源性熱原檢查法。 ? 尚未有藥典收載該法，但歐洲藥典將會(huì)在 2022年率先收載該法。 ? IPT有取代 PT的趨勢(shì)。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 35 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（ BET） ? 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 ——使用鱟試劑檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的方法 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 36 歷史回顧 —— 鱟試劑的發(fā)明與 BET的應(yīng)用 ? 1956年，美國(guó)科學(xué)家 《 鱟的一種細(xì)菌性疾病 》 ，闡述了細(xì)菌內(nèi)毒素使鱟血凝固的現(xiàn)象，從此拉開(kāi)了 BET研究與應(yīng)用的帷幕。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 37 BET技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展的趨勢(shì)與特點(diǎn) BET取代 PT成為必然的趨勢(shì) ? 1980年的 USPXX版收載 BET法，但未規(guī)定任何品種應(yīng)用； ? 1999年 USPXXIV版規(guī)定 670種藥品作BET項(xiàng)，僅約 20種藥品保留 PT項(xiàng)。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 38 ? 1993年 CP1990版增補(bǔ)本收載 BET法，同樣未涉及任何品種使用；CP2022年版有 69個(gè)品種規(guī)定作 BET項(xiàng)。 CP2022年版有 112種藥品規(guī)定作 BET項(xiàng)。 ? 其它國(guó)家藥典對(duì)藥品的 BET項(xiàng)，同樣經(jīng)歷了從無(wú)到有，從少到多的過(guò)程。 BET取代 PT是已成為必然的趨勢(shì)。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 39 2022年版藥典 BET法將基本與“ BET國(guó)際協(xié)調(diào)方案 ” 一致。 順應(yīng)全球國(guó)際醫(yī)藥貿(mào)易一體化的需要，從 2022年 1月起，美國(guó)藥典（ USP），歐洲藥典（ EP）以及日本藥局方（ JP）開(kāi)始執(zhí)行統(tǒng)一的 BET法，即 “ BET國(guó)際協(xié)調(diào)方案 ” 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 40 ? 細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系 ? 熱原（ Progen）指臨床上能使哺乳類動(dòng)物產(chǎn)生熱原反應(yīng)的物質(zhì)。關(guān)于熱原的定義在學(xué)術(shù)上還有爭(zhēng)論。 ? 細(xì)菌內(nèi)毒素（ Endotoxin）革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的構(gòu)成成分，具有多種生物活性，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是脂多糖（ LPS）。 ? 熱原與內(nèi)毒素的關(guān)系在學(xué)術(shù)上仍有爭(zhēng)論，但 在GMP的條件下，在藥檢的范疇里，內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說(shuō)無(wú)內(nèi)毒素就無(wú)熱原，控制內(nèi)毒素就控制熱原 。 細(xì)菌內(nèi)毒素 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 41 內(nèi)毒素的分子結(jié)構(gòu) 沙門氏菌內(nèi)毒素分子的結(jié)構(gòu)示意圖 C D B A C D B A ——Glc—Gal—Glc—Hep—Hep—kDo—GlcN Gal Hep Hep—P P kDo kDo GlcN P—P—EtN P—AraN Re Rd Rb Ra n O特異側(cè)鏈 核心區(qū) 類脂 A 內(nèi)毒素的分子結(jié)構(gòu)： 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 43 內(nèi)毒素的生物活性 ? 致熱性； ? 致死性； ? 引起血液白細(xì)胞中的粒細(xì)胞下降； ? 產(chǎn)生“施瓦茲夏”現(xiàn)象； ? 激活凝血系統(tǒng)； ? 血壓下降； ? 誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素的耐受性； ? 引起淋巴細(xì)胞的有絲分裂； ? 誘導(dǎo)抗感染的非特異性； ? 殺死腫瘤細(xì)胞； ? 與鱟試劑反應(yīng)； ? 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素與環(huán)境內(nèi)毒素 1) 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 指經(jīng)人工提取精制并經(jīng)生物效價(jià)測(cè)定的細(xì)菌內(nèi)毒素，作為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的參考品或?qū)φ掌贰? 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品 （ IS） 參考標(biāo)準(zhǔn)品 （ RSE） 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品 （ NS） 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 工作標(biāo)準(zhǔn)品 （ CSE） 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 45 2)環(huán)境內(nèi)毒素（ EET） 天然產(chǎn)生的內(nèi)毒素，普遍存在于水、空氣和各種原料中，成分除了脂多糖外還含有較多的蛋白質(zhì)、多糖和其它雜質(zhì)。 3)精制內(nèi)毒素與環(huán)境內(nèi)毒素的差異 組 成 ：精制內(nèi)毒素 ——脂、多糖，具有兩極活性； 環(huán)境內(nèi)毒素 ——脂、多糖、蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，兩 極活性不明顯 致熱性 ：精制內(nèi)毒素 ——致熱性強(qiáng)； 環(huán)境內(nèi)毒素 ——致熱性較弱 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 46 ? 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 ? CP2022年版規(guī)定內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶解后要在旋渦混合器上混合 15分鐘，以后的每一步稀釋前要至少混合 30秒，其他國(guó)家藥典也有類似要求； ? 具有兩極活性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布； ? 不按要求進(jìn)行旋渦混合會(huì)使所稀釋的內(nèi)毒素效價(jià)偏低，造成靈敏度標(biāo)示偏高、陽(yáng)性對(duì)照不凝等不正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 48 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 49 鱟試劑 ? 認(rèn)識(shí)：一種海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，藍(lán)色的血液。 ? 種類以及分布： – 美洲鱟：北美洲東岸海域 – 中國(guó)鱟：中國(guó)東南沿海 – 南方鱟：泰國(guó)和馬來(lái)群島海域 – 圓尾鱟：東南亞西部海域 ? 鱟的保護(hù)： – 由于生長(zhǎng)慢，捕殺惡劣，資源頻臨滅絕，我們公司一般在采鱟血后，又將其及時(shí)放歸大海，這樣并不影響鱟的生存。 鱟 — 四億年前就存在的古老的海洋生物 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 50 這就是鱟 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 51 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 52 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 53 鱟試劑：鱟血液變形細(xì)胞裂解物冷凍干燥制備而成 鱟試劑的種類：依據(jù)鱟的種類分： 美洲鱟試劑（ LAL） 中國(guó)鱟試劑（ TAL） 圓尾鱟試劑（ CAL） 依據(jù)檢查方法分： 凝膠法鱟試劑和定量法鱟試劑 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 54 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 55 ? 鱟試劑的主要質(zhì)量指標(biāo) ? 靈敏度：表示在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定的條件下，能檢測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素水溶液中最低內(nèi)毒素濃度。以EU/ml為單位，靈敏度的標(biāo)示值用字母 “ ?”表示。 ? 自身凝集 ? 緩沖能力 ? 干燥失重 ? 無(wú)菌 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 56 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 ? 凝膠法 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于 滅菌注射用水 。 ? 定量測(cè)定用的 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 ， 其內(nèi)毒素的含量應(yīng)小于。 C因子 活化的 C因子 內(nèi)毒素 活化的 B因子 B因子 凝固酶 凝固酶原 凝固蛋白 （ 凝膠 ） 凝固蛋白原 β (1,3)D葡聚糖或 LALRM 活化的 G因子 （旁路反應(yīng)） G因子 二價(jià)陽(yáng)離子 凝膠法鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理 ——復(fù)雜的酶促反應(yīng)過(guò)程 凝膠限量法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 編號(hào) 內(nèi)毒素濃度 /配制內(nèi)毒素的溶液 平行管數(shù) A 無(wú) /供試品溶液 2 B 2λ/供試品溶液 2 C 2λ/檢查用水 2 D 無(wú) /檢查用水 2 凝膠限量試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2022版藥典 溶液 平行管數(shù) ? NPC 2 ? NC 1 ? PC 1 ? PPC 1 ? 試驗(yàn)有效性： NC為陰性，PC和 PPC均為陽(yáng)性。 2022修改版 溶液 平行管數(shù) ? NPC 2 ? NC 2 ? PC 2 ? PPC 2 ? 試驗(yàn)有效性： NC均為陰性， PC和 PPC均為陽(yáng)性。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 60 ? 藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值 ： 一般標(biāo)準(zhǔn)上已經(jīng)給出 。 如 ， 。 ? 如：注射用頭孢拉定L=， 注射用頭孢曲松鈉 L= 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 61 1． 實(shí)驗(yàn)器材和準(zhǔn)備工作 ? 鱟試劑 （ 注意選擇規(guī)格和靈敏度 λ ） ：例：選用裝量為 ， 靈敏度 λ 為 。 ? 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 ：專用水 ， 內(nèi)毒素含量小于 。 ? 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 ： 10500EU/支 ，中國(guó)藥品行物制品檢定所生產(chǎn) 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 62 ? 2． 樣品供試液的制備 ： 樣品數(shù)量：取樣品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 （ 特殊要求的另作規(guī)定 ） 溶解并稀釋 。供試液制備：在 無(wú)菌條件下 進(jìn)行 . ? 液體類 ：取供試品直接稀釋：根據(jù)供 試 品 的 內(nèi) 毒 素 限 值 （ 如L=)和所用鱟試劑的靈敏度 λ （ 如 λ =)進(jìn)行 ， 稀釋倍數(shù) =L/λ =2 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 63 ?