【正文】 seradish peroxidase, chemiluminescent substrate, acridinium ester, synthesis 中國藥科大學(xué)本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì) ) 2 前言 辣根氧化物酶 由辣根等植物的根部提取而來，是一種含糖量為 18%，分子量為44000D的糖蛋白。辣根過氧化物酶 分子 的氧化還原中心為亞鐵血紅素，辣根過氧化物酶對芳香族等化合物 具有 良好的 催化氧化性能 。相比較于其他過氧化物酶來說，辣根過氧化物酶有其自身的優(yōu)點(diǎn)，如 原料易得 ,市場 價格 比較便宜 ,作用底物 十分寬泛等 ,這使得辣根過氧化物酶成為過氧化物酶中應(yīng)用十分廣泛的一種酶?，F(xiàn)在，辣根過氧化物酶已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域之中，在免疫分析、 有機(jī)合成、食品分析等方面 ，辣根過氧化物酶都發(fā)揮了重要的作用。例如 在有機(jī)合成 之中，可 作為催化劑使用 ,對苯胺 、 酚類 等芳香族化合物都具 有很高的催化 效能； 在酶免疫 分析檢測 中 ,辣根過氧化物酶 具有 化學(xué) 發(fā)光底物 ,因此而建立的化學(xué)發(fā)光免疫測定在臨床中得到廣泛應(yīng)用 【 2】 。 化學(xué)發(fā)光分析檢測靈敏度高、本底低 , 因此作為辣根過氧化物酶的底物的化學(xué)發(fā)光試劑的研究和制備是化學(xué)發(fā)光免疫檢測的熱點(diǎn)。其中吖啶酯衍生物是一種常見的化學(xué)發(fā)光試劑 【 2】 ，因此 本 論 文 研究的目的是對 兩 種 吖啶酯衍生物 的合成方法進(jìn)行探索 ， 合成三種不同的吖啶酯的衍生物，并在將來的工作中對各種吖啶酯的化合物的發(fā)光性能進(jìn)行研究。 中國藥科大學(xué)本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì) ) 3 第一章 辣根過氧化物酶的底物發(fā)展 【 3】 色原底物 最早發(fā)現(xiàn)的 辣根過氧化物酶的 底物是色原 ， 色原底物經(jīng)過酶的作用會產(chǎn)生一種新的顏色或其吸收光譜產(chǎn)生變化 ， 這種檢測方法所產(chǎn)生的顏色很容易用肉眼或光譜儀器觀測到是它最大的優(yōu)點(diǎn) ，對比之下， 檢測儀器所需的價格較其他檢測方法更加便宜 ， 但檢測靈敏度較其他檢測方法來說較低是其不足之處。 不同取代的芳香族胺和酚可以用來表示色原底物的基本結(jié)構(gòu) ，在 酶促氧化的過程之中，大多數(shù)不同取代的芳香胺、酚類或者它們的混合物會產(chǎn)生有顏色的縮聚物，易于觀測。下面簡單介紹幾種常見的芳香族胺類色原底物 :如 四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)、 5氨基水楊酸 (5AS)、鄰聯(lián)甲苯胺 (OT)等，這三種色原底物的結(jié)構(gòu)如下圖所示： H 2 N N H 2T M BH 2 N N H 2N H 2O HC O O H5 A SO T 熒光底物 繼色原底物之后，熒光底物的發(fā)現(xiàn)豐富了辣根過氧化物酶的的底物發(fā)展 ， 熒光底物檢測靈敏度比色原底物更高 ,更重要的是，熒光底物可以同時采用幾種不同顏色的熒光材料 ， 但與此同時，熒光底物也存在著其自身的缺點(diǎn) : 首先， 熒光的激發(fā)和檢測所需要的光源、過濾器和掃描儀等設(shè)備價格昂貴 ，相對色原底物來中國藥科大學(xué)本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì) ) 4 說， 檢測成本更高 ； 其次，經(jīng)由細(xì)胞或著其他分子產(chǎn)生的自發(fā)熒光同樣會對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生干擾；再次，在觀測期間、樣品存放期間、或者暴露于室內(nèi)光線時，熒光會發(fā)生衰減 , 導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)難以獲得恒定數(shù)據(jù)。 常見的化學(xué)發(fā)光底物 繼熒光底物之后，化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)現(xiàn)使得辣根過氧化物酶的底物發(fā)展進(jìn)入一個快速發(fā)展的階段 ，各種化學(xué)發(fā)光底物極大豐富了辣根過氧化物酶的應(yīng)用。化學(xué)發(fā)光指的是物質(zhì)分子在化學(xué)反應(yīng)的過程當(dāng)中吸收來自反應(yīng)的能量，并以光的形式將能量釋放出來的一種形式?；瘜W(xué)發(fā)光的發(fā)光機(jī)理反應(yīng)體系中某些物質(zhì)吸收了來自反應(yīng)所釋放的化學(xué)能，然后物質(zhì)分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)重新恢復(fù)到基態(tài)的狀態(tài)時，反應(yīng)體系所吸收的能量會以光的形式釋放出來，從而產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。顧名思義，化學(xué)發(fā)光是指在化學(xué)反應(yīng)的過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能被吸收使分子激發(fā)而發(fā)射的光，熒光則是吸收了光能使分子激發(fā)而發(fā)射的光，這就是化學(xué)發(fā)光與熒光的區(qū)別所在，暨二者形成激發(fā)態(tài) 分子的激發(fā)能的形式不同 ，一種為化學(xué)能，一種為光能。 一般來說，化學(xué)發(fā)光底物具有高能化學(xué)鍵 ， 酶的作用下，化學(xué)鍵會發(fā)生斷裂 ， 能量以可見光的形式釋放?；瘜W(xué)發(fā)光所需的檢測儀器價格昂貴，發(fā)射光須隨時采集，難以得到恒定值，但化學(xué)發(fā)光檢測靈敏度高、背景低 , 因而得到廣泛應(yīng)用 【 4】 。下面簡單介紹幾種常見的化學(xué)發(fā)光底物，包括魯米諾類、過氧草酸酯類，以及吖啶酯類，它們在實(shí)際的化學(xué)分析測定中是常用的幾種化學(xué)發(fā)光試劑，在藥物分析，環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域也有著重要的應(yīng)用： 魯米諾化學(xué)發(fā)光體系 魯米諾，化學(xué)名 為 3氨基鄰苯二甲酰肼， 其結(jié)構(gòu)簡單易于合成、性質(zhì)穩(wěn)定、水溶性好、環(huán)境友好且無毒，是應(yīng)用最多的化學(xué)發(fā)光試劑之一，并以 研究最多、化學(xué)發(fā)光效率高而著稱 【 5】 。 魯米諾作為一種常用的化學(xué)發(fā)光試劑可以用于多種物質(zhì)的分析檢測，如過氧化氫酶、辣根過氧化酶、鐵鹽、過渡金屬離子等均可以作為氧化劑或催化劑增強(qiáng)中國藥科大學(xué)本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì) ) 5 魯米諾的化學(xué)發(fā)光。上述物質(zhì)通過影響魯米諾的化學(xué)發(fā)光速率，而進(jìn)一步影響魯米諾的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，因此，魯米諾可以用于上述物質(zhì)的檢測 【 6】 。 雖然魯米諾可用于多種物質(zhì)的分析檢測，但至今為止，魯米諾的化學(xué)發(fā)光機(jī)理仍未闡釋清楚，主要原因在于捕獲和分離 反應(yīng)中間 體 十分困難 ，所以，機(jī)理 中仍然有一些細(xì)節(jié) 難以 明確。 下面給出魯米諾的一種可能的化學(xué)發(fā)光機(jī)理： 如圖展示了一種可能的魯米諾的發(fā)光機(jī)制 【 7】 ： 該機(jī)制經(jīng)歷四個階段： 第一階段： luminol→ LH （ luminol 在堿性環(huán)境作用下，生成 LH 陰離子）； 第二階段： LH → L （ LH .）（ LH 陰離子在氧化劑的作用下，生成 LH。 自由基或 L 陰離子）； 第三階段： L → LHOOH（ L 自由基在過氧化物的作用下，生成 LHOOH）； 第四階段： LHOOH → 3氨基鄰苯二甲酸根負(fù)離子 *+N2（ LHOOH脫去 N2，生成 3氨基鄰苯二甲酸根負(fù)離子的激發(fā)態(tài)物質(zhì)），最后，激發(fā)態(tài)物質(zhì)回到基態(tài)的過程中，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光 【 8】 。 魯米諾可以用于多種類型的離子的測定，例如可以用于金屬離子的含量測定，關(guān)于測定海水中鐵離子含量的方法已經(jīng)建立起來，并應(yīng)用于海洋環(huán)境監(jiān)測之中；與此同時，在過渡金屬檢測和堿土金屬離