【正文】 間的疏水相互作用；親和力愈大愈難洗脫！ 第四章：蛋白質（重點） ?蛋白質概況； ?蛋白質的共價結構； ?蛋白質的三維結構； ?蛋白質的結構與功能的關系； ?蛋白質的分離、純化與鑒定； 相關概念總結 構象： 指具有相同結構式和相同構型的分子在空間里可能的多種形態(tài)；構象形態(tài)間的改變不涉及共價鍵的破裂！每一種天然蛋白質都有自己特有的空間結構或三維結構，稱之為蛋白質的構象；一個給定的蛋白質可以有多種構象，但只有一種或少數(shù)幾種在能量上是有利的。 蛋白質的結構 一級結構（即共價結構，指多肽鏈的氨基酸序列） 二級結構（指多肽鏈借助氫鍵形成 α螺旋和 β折疊片） 三級結構（指多肽鏈借助各種非共價鍵彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀結構） 四級結構（指多聚蛋白質的各亞基之間在空間上的相互締合關系） 氨基酸殘基： 肽鏈中的氨基酸由于參加肽鍵的形成因而 不在是原來完整的分子，稱為氨基酸殘基；兩個氨基酸形成一個肽鍵時失去一分子水，因此失去的水分子數(shù)比氨基酸殘基數(shù)少一個。每個氨基酸殘基的平均分子量為 110。氨基酸的平均分子量為 128。 肽： 由兩個或多個氨基酸殘基通過肽鍵相連而形成的化合物；肽有寡肽和多肽之分。一條肽鏈通常在一端含有一個游離的末端氨基，稱為 N末端，而另一端含有一個游離的末端羧基稱為 C末端； Edman化學降解法： 用 Edman試劑 PITC與游離氨基作用生成PTH氨基酸，并可用各種層析技術分離；用此法降解，一次可連續(xù)測出 6070個氨基酸殘基的序列 同源蛋白質： 在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質 稱同源蛋白質。同源蛋白質具有共同的進化起源。同源蛋白質具有明顯的氨基酸序列相似性，稱之為序列同源。根據(jù)同源蛋白質的氨基酸序列資料可建立系統(tǒng)樹（進化樹）。兩個物種的同源蛋白質，其序列中氨基酸的差異數(shù)目與這些物種間的進化發(fā)生差異是成比例的。 蛋白質激活： 在生物體內(nèi)有些蛋白質是以前體形式合成，不具有活性，只有按一定方式裂解除去部分肽鏈后才具有生物活性，稱之為蛋白質激活。如酶原激活。 固相肽合成 ：是控制合成技術的巨大進步，利用固相肽合成儀已成功合成多種肽和蛋白質。其實質是肽的羧基端第一個氨基酸共價掛接在樹脂上，然后加入氨基受保護的第二個氨基酸并發(fā)生縮合反應，形成肽鍵，依次類推。最后是肽與樹脂斷裂并去掉氨基端的保護基團。 超二級結構： 由若干相鄰的二級結構元件組合在一起，彼此相互作用，形成種類不多，有規(guī)則的 二級結構串，并在多種蛋白質中充當三級結構的構件，稱為超二級結構。已知有 3種基本形式： αα、 βαβ、 ββ。 結構域： 在多肽鏈上由二級結構元件或超二級結構形成的相對獨立的 緊密球狀實體，是三級結構的局部折疊區(qū)。較小的球狀蛋白質或亞基是單結構域，而較大的球狀蛋白質或亞基是多結構域。結構域可分 4類：全 α結構、 α， β結構、全 β結構和富含金屬或二硫鍵結構域。 蛋白質變性： 天然蛋白質分子在受到理化因素的作用時導致溶解度降低、不對稱性增高、生物活性喪失及理化特性改變，此過程稱之為蛋白質變性。 蛋白質變性的實質是分子中次級鍵被破壞，引起天然構象解體。變性不涉及共價鍵破壞，即蛋白質一級結構仍保持完好。當變性因素除去后，變性蛋白質又可重新回復到天然構象，此為蛋白質的復性。是否蛋白質變性與復性可逆，仍有疑問。 蛋白質折疊： 蛋白質折疊不是隨機的而是通過累積選擇找到自由能最低的構象；折疊需要折疊酶和分子伴侶參加。 分子伴侶： 是一類與蛋白質折疊有關的蛋白質家族（來源相同、結構相似、功能相關），它們通過抑制新生肽鏈不正常的聚集并排除與其他蛋白質不合理的結合而協(xié)助多肽鏈的正確折疊。 血紅蛋白分子?。?導致一個蛋白質中氨基酸改變的基因突變能產(chǎn)生分子病，這是一種遺傳病。了解最清楚的分子病是鐮刀狀細胞貧血病，該病人的不正常的血紅蛋白稱 HbS，它 只是在兩條 β鏈的 N端第 6位上 Glu被 Val置換 。這一改變使血紅蛋白表面產(chǎn)生一個疏水小區(qū)，導致血紅蛋白聚集成不溶性的纖維束，并引起紅細胞鐮刀狀化和輸氧能力降低。地中海貧血是由于缺失一個或多個編碼血紅蛋白鏈的基因造成的。 別構效應： 別構部位與配體的結合可能影響其他亞基，使這些亞基構象改變，增強或減弱對底物的結合。 協(xié)同效應 正協(xié)同效應 ：引起與配體結合能力的增強（激活） 負協(xié)同效應： 引起與配體結合能力的減弱（抑制） 正效應物： 促進活性部位與配基結合的別構效應物 。 負效應物： 抑制活性部位與配基結合的別構效應物 。 別構蛋白： 除了有活性部位 （ 結合底物 ） 外 ， 還有別構部位（ 結合調(diào)節(jié)物 ） 。 有時活性部位和別構部位分屬不同的亞基（ 活性亞基和調(diào)節(jié)亞基 ） ， 活性部位之間以及活性部位和調(diào)節(jié)部位之間通過蛋白質構象的變化而相互作用 。 等電聚焦 ：也稱電聚焦，是一種高分辨率的蛋白質分離技術，也可用于蛋白質等電點的測定。在外加電場時，蛋白質混合物在具有 pH梯度的介質中移向并聚焦（停留）在等于其等電點的 pH處，形成區(qū)帶。 密度梯度離心 ：蛋白質顆粒在具有密度梯度的介質中離心時，質量和密度大的顆粒比質量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質顆粒沉降到與其自身密度相等的介質密度梯度時，即停止不前，最后各種蛋白質在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。 鹽溶和鹽析： 中性鹽在低濃度時可增加蛋白質的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強；當離子強度增大到足夠高時，此時與蛋白質疏水基團接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子，導致蛋白質疏水基團暴露，使蛋白質因疏水作用凝聚沉淀。 親和層析： 是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力，也即生物學親和力，建立起來的一種有效的純化方法。 蛋白質純化的總目標： 是增加制品的純度，即設法除去變性的和不需要的蛋白質以增加單位蛋白質重量中所需蛋白質的含量或生物活性。分離純化蛋白質的程序為：前處理（細胞或組織處理）、粗分級分離（除去雜蛋白）和細分級分離。 蛋白質概況 蛋白質的化學組成：碳（ 50%）、氫（ 7%）、氧（ 23%）、氮（ 16%）、硫（ 03%）、其它元素微量；蛋白質的平均含氮量為 16%，此為凱氏定氮法測定蛋白質含量的基礎。 分類 Ⅰ 單純蛋白質（如清蛋白、球蛋白、組蛋白、谷蛋白、硬蛋白等） 綴合蛋白質（如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白等） 分類 Ⅱ ： 按生物學功能可將蛋白質分為酶、調(diào)節(jié)蛋白、結構蛋白、轉運蛋白等等； 分類 Ⅲ 分類 Ⅳ 纖維狀蛋白質（一般不溶于水。典型的有：膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白、絲蛋白、肌球蛋白等） 球狀蛋白質（可溶性好。典型的有：胞質酶類等） 膜蛋白（與細胞的膜系統(tǒng)結合而存在） 單體蛋白質 （寡）多聚蛋白質 蛋白質結構的層次 構象： 指具有相同結構式和相同構型的分子在空間里可能的多種形態(tài)；構象形態(tài)間的改變不涉及共價鍵的破裂！每一種天然蛋白質都有自己特有的空間結構或三維結構，稱之為蛋白質的構象；一個給定的蛋白質可以有多種構象，但只有一種或少數(shù)幾種在能量上是有利的。 蛋白質的結構 一級結構（即共價結構，指多肽鏈的氨基酸序列） 二級結構（指多肽鏈借助氫鍵形成 α螺旋和 β折疊片） 三級結構（指多肽鏈借助各種非共價鍵彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀結構） 四級結構（指多聚蛋白質的各亞基之間在空間上的相互締合關系） 蛋白質的一級結構即多肽鏈的氨基酸序列決定蛋白質的高級結構！ 蛋白質的功能： 催化、調(diào)節(jié)、轉運、儲存、運動、結構組分、支架作用、免疫、異常功能； Ⅱ 蛋白質的共價結構（一級結構） 氨基酸殘基、 肽（鍵）、 蛋白質一級結構的測定、氨基酸序列與生物功能 、 肽的人工合成 氨基酸殘基： 肽鏈中的氨基酸由于參加肽鍵的形成因而 不在是原來完整的分子，稱為氨基酸殘基；兩個氨基酸形成一個肽鍵時失去一分子水，因此失去的水分子數(shù)比氨基酸殘基數(shù)少一個。每個氨基酸殘基的平均分子量為110。氨基酸的平均分子量為 128。 肽： 由兩個或多個氨基酸殘基通過肽鍵相連而形成的化合物；肽有寡肽和多肽之分。一條肽鏈通常在一端含有一個游離的末端氨基，稱為 N末端，而另一端含有一個游離的末端羧基稱為 C末端； 肽鍵 具有部分雙鍵的性質 肽鍵比一般碳 氮單鍵短 與肽鍵相連的氫原子和氧原子呈反式構型 肽鍵不可自由旋轉 肽的理化性質： ①肽鍵的酰氨氫不解離，肽的酸堿性質主要決定于肽鍵中的游離末端 αNH αCOOH及側鏈 R基上的可解離基團； ②肽中末端 α羧基的 pKa值比游離氨基酸的大，末端 α氨基的 pKa值比游離氨基酸的?。? ③游離的 α氨基、 α羧基和 R基可發(fā)生與氨基酸中相應的類似反應，如茚三酮反應等； ④蛋白質部分水解后所得的肽若不發(fā)生消旋，則具有旋光性，短肽的 旋光度約等于組成氨基酸的旋光度之和，較長的肽的旋光度則不是簡單加和； 活性肽： 具特殊的生物學功能的肽段，如腦啡肽、谷胱甘肽、肌肽等； 肽 蛋白質一級結構的測定 測定多肽鏈的數(shù)目 蛋 白 質 測 序 的 步 驟 拆分多肽鏈 斷開多肽鏈內(nèi)的二硫鍵 測定每一肽鏈的氨基酸組成 鑒定多肽鏈的 N末端和 C末端 裂解多肽鏈為較小的肽段 測定各肽段的氨基酸序列 利用重疊肽重建完整多肽鏈的一級結構 確定二硫鍵的位置 蛋白質測序的重要方法 N末端測定 二硝基氟苯（ DNFB）法：肽游離末端 NH2與 DNFB反應生成 DNP肽，最后水解生成黃色 DNP氨基酸 丹磺酰氯（ DNS）法：用 DNS取代 DNFB，生成 DNS氨基酸 苯異硫氰酸（ PITC）法：生成 PTH氨基酸，從肽上斷裂下來 氨肽酶法：外切酶，但效果不好 C末端測定 肼解法：測定 C末端的最重要的化學方法，肽與肼反應，除C末端氨基酸游離外，其他氨基酸轉變?yōu)榘被狨ｋ禄? 還原法： C末端氨基酸用硼氫化鋰還原成相應的 α氨基醇 羧肽酶法：最有效、最常用 羧肽酶 A 羧肽酶 B 羧肽酶 C 羧肽酶 Y 二硫鍵的斷裂 過甲酸氧化法：將二硫鍵氧化成磺酸基 巰基化合物還原法：將二硫鍵還原成巰基，然后用烷基化試劑如碘乙酸保護巰基，防止其重新被氧化 氨基酸組成的測定： 酸水解：是主要方法，多用 HCl，同時輔以堿水解；所得氨基酸不消旋，但 Trp全部被破壞， Ser， Thr， Tyr部分破壞， Asn和 Gln的酰氨基被水解，生成 Asp和 Glu； 多肽鏈的裂解 酶裂解： 胰蛋白酶 ：專一性強，斷裂 Lys或 Arg的羧基參與形成的肽鍵 糜蛋白酶 ：斷裂 Phe， Trp， Tyr， Leu等疏水氨基酸的羧基端肽鍵 嗜熱菌蛋白酶 ：專一性差，斷裂 Val， Leu，Phe， Tyr， Trp等氨基參與形成的肽鍵 胃蛋白酶：在酸性條件穩(wěn)定，肽鍵 兩側均為疏水氨基酸。在確定二硫鍵位置時，常用到此酶。 其它酶：略 化學裂解： 溴化氰（ CNBr）：只斷裂 Met的羧基形成的肽鍵 羥氨（ NH2OH）：在 pH9時，專一性斷裂AsnGly之間的肽鍵，其它條件下不專一 肽段的氨基酸測序 Edman化學降解法： 用 Edman試劑 PITC與游離氨基作用生成 PTH氨基酸，并可用各種層析技術分離；用此法降解，一次可連續(xù)測出 6070個氨基酸殘基的序列；工作量大，操作麻煩；現(xiàn)改用蛋白質測序儀。 酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困難 質譜法：質譜儀 由核苷酸序列推定法： mRNA cDNA ，推出 cDNA的核苷酸序列，然后推測出蛋白質的氨基酸序列 肽段在肽鏈中次序的確定： 需借助重疊肽。 重疊肽：由于不同的斷裂方法即斷裂的專一性不同，產(chǎn)生的切口彼此錯位，使兩套肽段正好跨過切口而重疊的肽段；獲得重疊肽需要兩種或兩種以上的不同方法斷裂同一多肽樣品，得到兩套或多套肽段。 二硫鍵位置的確定： 一般采用胃蛋白酶水解原來的含二硫鍵的蛋白質。一是胃蛋白酶專一低，切點多，得到含有二硫鍵的肽段較小，易分離鑒定；二是在酸性條件下，有利于防止二硫鍵發(fā)生交換反應。 蛋白質的氨基酸序列與生物功能；肽合成 同源蛋白質： 在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質稱同源蛋白質。同源蛋白質具有共同的進化起源。同源蛋白質具有明顯的氨基酸序列相似性，稱之為序列同源。根據(jù)同源蛋白質的氨基酸序列資料可建立系統(tǒng)樹（進化樹）。兩個物種的同源蛋白質，其序列中氨基酸的差異數(shù)目與這些物種間的進化發(fā)生差異是成比例的。 蛋白質激活： 在生物體內(nèi)有些蛋白質是以前體形式合成，不具有活性，只有按一定方式裂解除去部分肽鏈后才具有生物活性，稱之為蛋白質激活。如酶原激活。 肽的人工合成： 氨基酸共聚合（由一種或兩種氨基酸反應） 控制合成（由不同氨基酸按一