【正文】 間的疏水相互作用；親和力愈大愈難洗脫！ 第四章：蛋白質(zhì)（重點(diǎn)） ?蛋白質(zhì)概況； ?蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)； ?蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)； ?蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系； ?蛋白質(zhì)的分離、純化與鑒定； 相關(guān)概念總結(jié) 構(gòu)象： 指具有相同結(jié)構(gòu)式和相同構(gòu)型的分子在空間里可能的多種形態(tài)；構(gòu)象形態(tài)間的改變不涉及共價(jià)鍵的破裂！每一種天然蛋白質(zhì)都有自己特有的空間結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)，稱之為蛋白質(zhì)的構(gòu)象；一個(gè)給定的蛋白質(zhì)可以有多種構(gòu)象，但只有一種或少數(shù)幾種在能量上是有利的。 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 一級(jí)結(jié)構(gòu)（即共價(jià)結(jié)構(gòu)，指多肽鏈的氨基酸序列） 二級(jí)結(jié)構(gòu)（指多肽鏈借助氫鍵形成 α螺旋和 β折疊片） 三級(jí)結(jié)構(gòu)（指多肽鏈借助各種非共價(jià)鍵彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀結(jié)構(gòu)） 四級(jí)結(jié)構(gòu)（指多聚蛋白質(zhì)的各亞基之間在空間上的相互締合關(guān)系） 氨基酸殘基： 肽鏈中的氨基酸由于參加肽鍵的形成因而 不在是原來完整的分子，稱為氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸形成一個(gè)肽鍵時(shí)失去一分子水，因此失去的水分子數(shù)比氨基酸殘基數(shù)少一個(gè)。每個(gè)氨基酸殘基的平均分子量為 110。氨基酸的平均分子量為 128。 肽： 由兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基通過肽鍵相連而形成的化合物；肽有寡肽和多肽之分。一條肽鏈通常在一端含有一個(gè)游離的末端氨基，稱為 N末端，而另一端含有一個(gè)游離的末端羧基稱為 C末端； Edman化學(xué)降解法： 用 Edman試劑 PITC與游離氨基作用生成PTH氨基酸，并可用各種層析技術(shù)分離；用此法降解，一次可連續(xù)測(cè)出 6070個(gè)氨基酸殘基的序列 同源蛋白質(zhì)： 在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì) 稱同源蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化起源。同源蛋白質(zhì)具有明顯的氨基酸序列相似性，稱之為序列同源。根據(jù)同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列資料可建立系統(tǒng)樹（進(jìn)化樹）。兩個(gè)物種的同源蛋白質(zhì)，其序列中氨基酸的差異數(shù)目與這些物種間的進(jìn)化發(fā)生差異是成比例的。 蛋白質(zhì)激活： 在生物體內(nèi)有些蛋白質(zhì)是以前體形式合成，不具有活性，只有按一定方式裂解除去部分肽鏈后才具有生物活性，稱之為蛋白質(zhì)激活。如酶原激活。 固相肽合成 ：是控制合成技術(shù)的巨大進(jìn)步，利用固相肽合成儀已成功合成多種肽和蛋白質(zhì)。其實(shí)質(zhì)是肽的羧基端第一個(gè)氨基酸共價(jià)掛接在樹脂上，然后加入氨基受保護(hù)的第二個(gè)氨基酸并發(fā)生縮合反應(yīng)，形成肽鍵，依次類推。最后是肽與樹脂斷裂并去掉氨基端的保護(hù)基團(tuán)。 超二級(jí)結(jié)構(gòu)： 由若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組合在一起，彼此相互作用，形成種類不多，有規(guī)則的 二級(jí)結(jié)構(gòu)串，并在多種蛋白質(zhì)中充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)件，稱為超二級(jí)結(jié)構(gòu)。已知有 3種基本形式： αα、 βαβ、 ββ。 結(jié)構(gòu)域： 在多肽鏈上由二級(jí)結(jié)構(gòu)元件或超二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的相對(duì)獨(dú)立的 緊密球狀實(shí)體，是三級(jí)結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)。較小的球狀蛋白質(zhì)或亞基是單結(jié)構(gòu)域，而較大的球狀蛋白質(zhì)或亞基是多結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域可分 4類：全 α結(jié)構(gòu)、 α， β結(jié)構(gòu)、全 β結(jié)構(gòu)和富含金屬或二硫鍵結(jié)構(gòu)域。 蛋白質(zhì)變性： 天然蛋白質(zhì)分子在受到理化因素的作用時(shí)導(dǎo)致溶解度降低、不對(duì)稱性增高、生物活性喪失及理化特性改變，此過程稱之為蛋白質(zhì)變性。 蛋白質(zhì)變性的實(shí)質(zhì)是分子中次級(jí)鍵被破壞，引起天然構(gòu)象解體。變性不涉及共價(jià)鍵破壞，即蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)仍保持完好。當(dāng)變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)又可重新回復(fù)到天然構(gòu)象，此為蛋白質(zhì)的復(fù)性。是否蛋白質(zhì)變性與復(fù)性可逆，仍有疑問。 蛋白質(zhì)折疊： 蛋白質(zhì)折疊不是隨機(jī)的而是通過累積選擇找到自由能最低的構(gòu)象；折疊需要折疊酶和分子伴侶參加。 分子伴侶： 是一類與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)的蛋白質(zhì)家族（來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)），它們通過抑制新生肽鏈不正常的聚集并排除與其他蛋白質(zhì)不合理的結(jié)合而協(xié)助多肽鏈的正確折疊。 血紅蛋白分子?。?導(dǎo)致一個(gè)蛋白質(zhì)中氨基酸改變的基因突變能產(chǎn)生分子病，這是一種遺傳病。了解最清楚的分子病是鐮刀狀細(xì)胞貧血病，該病人的不正常的血紅蛋白稱 HbS，它 只是在兩條 β鏈的 N端第 6位上 Glu被 Val置換 。這一改變使血紅蛋白表面產(chǎn)生一個(gè)疏水小區(qū)，導(dǎo)致血紅蛋白聚集成不溶性的纖維束，并引起紅細(xì)胞鐮刀狀化和輸氧能力降低。地中海貧血是由于缺失一個(gè)或多個(gè)編碼血紅蛋白鏈的基因造成的。 別構(gòu)效應(yīng)： 別構(gòu)部位與配體的結(jié)合可能影響其他亞基，使這些亞基構(gòu)象改變，增強(qiáng)或減弱對(duì)底物的結(jié)合。 協(xié)同效應(yīng) 正協(xié)同效應(yīng) ：引起與配體結(jié)合能力的增強(qiáng)（激活） 負(fù)協(xié)同效應(yīng)： 引起與配體結(jié)合能力的減弱（抑制） 正效應(yīng)物： 促進(jìn)活性部位與配基結(jié)合的別構(gòu)效應(yīng)物 。 負(fù)效應(yīng)物： 抑制活性部位與配基結(jié)合的別構(gòu)效應(yīng)物 。 別構(gòu)蛋白： 除了有活性部位 （ 結(jié)合底物 ） 外 ， 還有別構(gòu)部位（ 結(jié)合調(diào)節(jié)物 ） 。 有時(shí)活性部位和別構(gòu)部位分屬不同的亞基（ 活性亞基和調(diào)節(jié)亞基 ） ， 活性部位之間以及活性部位和調(diào)節(jié)部位之間通過蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化而相互作用 。 等電聚焦 ：也稱電聚焦，是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，也可用于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定。在外加電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)混合物在具有 pH梯度的介質(zhì)中移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的 pH處，形成區(qū)帶。 密度梯度離心 ：蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。 鹽溶和鹽析： 中性鹽在低濃度時(shí)可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強(qiáng)；當(dāng)離子強(qiáng)度增大到足夠高時(shí)，此時(shí)與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露，使蛋白質(zhì)因疏水作用凝聚沉淀。 親和層析： 是利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力，也即生物學(xué)親和力，建立起來的一種有效的純化方法。 蛋白質(zhì)純化的總目標(biāo)： 是增加制品的純度，即設(shè)法除去變性的和不需要的蛋白質(zhì)以增加單位蛋白質(zhì)重量中所需蛋白質(zhì)的含量或生物活性。分離純化蛋白質(zhì)的程序?yàn)椋呵疤幚恚?xì)胞或組織處理）、粗分級(jí)分離（除去雜蛋白）和細(xì)分級(jí)分離。 蛋白質(zhì)概況 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成：碳（ 50%）、氫（ 7%）、氧（ 23%）、氮（ 16%）、硫（ 03%）、其它元素微量；蛋白質(zhì)的平均含氮量為 16%，此為凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的基礎(chǔ)。 分類 Ⅰ 單純蛋白質(zhì)（如清蛋白、球蛋白、組蛋白、谷蛋白、硬蛋白等） 綴合蛋白質(zhì)（如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白等） 分類 Ⅱ ： 按生物學(xué)功能可將蛋白質(zhì)分為酶、調(diào)節(jié)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等等； 分類 Ⅲ 分類 Ⅳ 纖維狀蛋白質(zhì)（一般不溶于水。典型的有：膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白、絲蛋白、肌球蛋白等） 球狀蛋白質(zhì)（可溶性好。典型的有：胞質(zhì)酶類等） 膜蛋白（與細(xì)胞的膜系統(tǒng)結(jié)合而存在） 單體蛋白質(zhì) （寡）多聚蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的層次 構(gòu)象： 指具有相同結(jié)構(gòu)式和相同構(gòu)型的分子在空間里可能的多種形態(tài)；構(gòu)象形態(tài)間的改變不涉及共價(jià)鍵的破裂！每一種天然蛋白質(zhì)都有自己特有的空間結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)，稱之為蛋白質(zhì)的構(gòu)象；一個(gè)給定的蛋白質(zhì)可以有多種構(gòu)象，但只有一種或少數(shù)幾種在能量上是有利的。 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 一級(jí)結(jié)構(gòu)（即共價(jià)結(jié)構(gòu)，指多肽鏈的氨基酸序列） 二級(jí)結(jié)構(gòu)（指多肽鏈借助氫鍵形成 α螺旋和 β折疊片） 三級(jí)結(jié)構(gòu)（指多肽鏈借助各種非共價(jià)鍵彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀結(jié)構(gòu)） 四級(jí)結(jié)構(gòu)（指多聚蛋白質(zhì)的各亞基之間在空間上的相互締合關(guān)系） 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)即多肽鏈的氨基酸序列決定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)！ 蛋白質(zhì)的功能： 催化、調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存、運(yùn)動(dòng)、結(jié)構(gòu)組分、支架作用、免疫、異常功能； Ⅱ 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)（一級(jí)結(jié)構(gòu)） 氨基酸殘基、 肽（鍵）、 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定、氨基酸序列與生物功能 、 肽的人工合成 氨基酸殘基： 肽鏈中的氨基酸由于參加肽鍵的形成因而 不在是原來完整的分子，稱為氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸形成一個(gè)肽鍵時(shí)失去一分子水，因此失去的水分子數(shù)比氨基酸殘基數(shù)少一個(gè)。每個(gè)氨基酸殘基的平均分子量為110。氨基酸的平均分子量為 128。 肽： 由兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基通過肽鍵相連而形成的化合物；肽有寡肽和多肽之分。一條肽鏈通常在一端含有一個(gè)游離的末端氨基，稱為 N末端，而另一端含有一個(gè)游離的末端羧基稱為 C末端； 肽鍵 具有部分雙鍵的性質(zhì) 肽鍵比一般碳 氮單鍵短 與肽鍵相連的氫原子和氧原子呈反式構(gòu)型 肽鍵不可自由旋轉(zhuǎn) 肽的理化性質(zhì)： ①肽鍵的酰氨氫不解離，肽的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鍵中的游離末端 αNH αCOOH及側(cè)鏈 R基上的可解離基團(tuán)； ②肽中末端 α羧基的 pKa值比游離氨基酸的大，末端 α氨基的 pKa值比游離氨基酸的??； ③游離的 α氨基、 α羧基和 R基可發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)的類似反應(yīng)，如茚三酮反應(yīng)等； ④蛋白質(zhì)部分水解后所得的肽若不發(fā)生消旋，則具有旋光性，短肽的 旋光度約等于組成氨基酸的旋光度之和，較長(zhǎng)的肽的旋光度則不是簡(jiǎn)單加和； 活性肽： 具特殊的生物學(xué)功能的肽段，如腦啡肽、谷胱甘肽、肌肽等； 肽 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 測(cè)定多肽鏈的數(shù)目 蛋 白 質(zhì) 測(cè) 序 的 步 驟 拆分多肽鏈 斷開多肽鏈內(nèi)的二硫鍵 測(cè)定每一肽鏈的氨基酸組成 鑒定多肽鏈的 N末端和 C末端 裂解多肽鏈為較小的肽段 測(cè)定各肽段的氨基酸序列 利用重疊肽重建完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu) 確定二硫鍵的位置 蛋白質(zhì)測(cè)序的重要方法 N末端測(cè)定 二硝基氟苯（ DNFB）法：肽游離末端 NH2與 DNFB反應(yīng)生成 DNP肽，最后水解生成黃色 DNP氨基酸 丹磺酰氯（ DNS）法：用 DNS取代 DNFB，生成 DNS氨基酸 苯異硫氰酸（ PITC）法：生成 PTH氨基酸，從肽上斷裂下來 氨肽酶法：外切酶，但效果不好 C末端測(cè)定 肼解法：測(cè)定 C末端的最重要的化學(xué)方法，肽與肼反應(yīng)，除C末端氨基酸游離外，其他氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘被狨ｋ禄? 還原法： C末端氨基酸用硼氫化鋰還原成相應(yīng)的 α氨基醇 羧肽酶法：最有效、最常用 羧肽酶 A 羧肽酶 B 羧肽酶 C 羧肽酶 Y 二硫鍵的斷裂 過甲酸氧化法：將二硫鍵氧化成磺酸基 巰基化合物還原法：將二硫鍵還原成巰基，然后用烷基化試劑如碘乙酸保護(hù)巰基，防止其重新被氧化 氨基酸組成的測(cè)定： 酸水解：是主要方法，多用 HCl，同時(shí)輔以堿水解；所得氨基酸不消旋，但 Trp全部被破壞， Ser， Thr， Tyr部分破壞， Asn和 Gln的酰氨基被水解，生成 Asp和 Glu； 多肽鏈的裂解 酶裂解： 胰蛋白酶 ：專一性強(qiáng)，斷裂 Lys或 Arg的羧基參與形成的肽鍵 糜蛋白酶 ：斷裂 Phe， Trp， Tyr， Leu等疏水氨基酸的羧基端肽鍵 嗜熱菌蛋白酶 ：專一性差，斷裂 Val， Leu，Phe， Tyr， Trp等氨基參與形成的肽鍵 胃蛋白酶：在酸性條件穩(wěn)定，肽鍵 兩側(cè)均為疏水氨基酸。在確定二硫鍵位置時(shí)，常用到此酶。 其它酶：略 化學(xué)裂解： 溴化氰（ CNBr）：只斷裂 Met的羧基形成的肽鍵 羥氨（ NH2OH）：在 pH9時(shí)，專一性斷裂AsnGly之間的肽鍵，其它條件下不專一 肽段的氨基酸測(cè)序 Edman化學(xué)降解法： 用 Edman試劑 PITC與游離氨基作用生成 PTH氨基酸，并可用各種層析技術(shù)分離；用此法降解，一次可連續(xù)測(cè)出 6070個(gè)氨基酸殘基的序列；工作量大，操作麻煩；現(xiàn)改用蛋白質(zhì)測(cè)序儀。 酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困難 質(zhì)譜法：質(zhì)譜儀 由核苷酸序列推定法： mRNA cDNA ，推出 cDNA的核苷酸序列，然后推測(cè)出蛋白質(zhì)的氨基酸序列 肽段在肽鏈中次序的確定： 需借助重疊肽。 重疊肽：由于不同的斷裂方法即斷裂的專一性不同，產(chǎn)生的切口彼此錯(cuò)位，使兩套肽段正好跨過切口而重疊的肽段；獲得重疊肽需要兩種或兩種以上的不同方法斷裂同一多肽樣品，得到兩套或多套肽段。 二硫鍵位置的確定： 一般采用胃蛋白酶水解原來的含二硫鍵的蛋白質(zhì)。一是胃蛋白酶專一低，切點(diǎn)多，得到含有二硫鍵的肽段較小，易分離鑒定；二是在酸性條件下，有利于防止二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)。 蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能；肽合成 同源蛋白質(zhì)： 在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)稱同源蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化起源。同源蛋白質(zhì)具有明顯的氨基酸序列相似性，稱之為序列同源。根據(jù)同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列資料可建立系統(tǒng)樹（進(jìn)化樹）。兩個(gè)物種的同源蛋白質(zhì)，其序列中氨基酸的差異數(shù)目與這些物種間的進(jìn)化發(fā)生差異是成比例的。 蛋白質(zhì)激活： 在生物體內(nèi)有些蛋白質(zhì)是以前體形式合成，不具有活性，只有按一定方式裂解除去部分肽鏈后才具有生物活性，稱之為蛋白質(zhì)激活。如酶原激活。 肽的人工合成： 氨基酸共聚合（由一種或兩種氨基酸反應(yīng)） 控制合成（由不同氨基酸按一