【正文】 行12塊膠, DALTsix同時(shí)運(yùn)行6塊膠)? 最適合18cm和24cm IPG 膠條? 緩沖液用量低： 12塊膠只需10L, 6塊膠只需5L圖6b. Ettan DALTsixEttan切點(diǎn)機(jī) 機(jī)器人系統(tǒng)，它能根據(jù)來自圖像分析軟件的切點(diǎn)列表自動地從染色或染色后脫色的凝膠中切取蛋白點(diǎn)并轉(zhuǎn)入微孔板中。圖7. Ettan切點(diǎn)機(jī)雙向電泳是樣品制備開始。雙向電泳下一個(gè)步驟是IPG干膠條的再水化。第一向等電聚焦是在有溫度控制和高電壓的條件下的平板電泳儀上進(jìn)行。平衡后，將IPG膠條放在第二向凝膠上進(jìn)行電泳。概括起來，雙向電泳的實(shí)驗(yàn)步驟為:1樣品的制備2 IPG干膠條的再水化 3 等電聚焦電泳（IEF）4 IPG膠條平衡5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）6 染色7 結(jié)果分析儀器的選擇根據(jù)電泳方法和等電聚焦（IEF）及SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）裝置可以選擇不同的設(shè)備。如果想要各種儀器操作的詳細(xì)數(shù)據(jù)，請參考各儀器的使用手冊。MultiphorⅡ(圖1)是一臺多功能儀器，它能用于一些不同的電泳技術(shù)。干膠條的再水化可以在Immobiline干膠條再泡脹盤(Immobiline DryStrip Reswelling Tray)內(nèi)進(jìn)行。224。這個(gè)設(shè)備能進(jìn)行最多達(dá)十二根水化后的同樣長度的IPG膠條進(jìn)行任何方式的等電聚焦（IEF）。用Ettan IPGphor等電聚焦系統(tǒng)在IPG膠條上等電聚焦進(jìn)行第一向的分離相當(dāng)簡單?？赏ㄟ^程序設(shè)定的電泳參數(shù)包括再水化溫度和時(shí)間、等電聚焦的溫度及最大電流，并且還可以控制在進(jìn)行一次分離過程中各步驟的時(shí)間及電壓的改變方式。由于干膠條再水化和等電聚焦（IEF）可在使用者不干預(yù)的情況下連續(xù)進(jìn)行，因此，它能無人值守過夜運(yùn)行。較少地IPG膠條的操作能產(chǎn)生更少故障，如：膠條混淆、污染、空氣接觸及尿素的結(jié)晶，由于可以利用高電壓，因此，分離速度非常快。表2. 等電聚焦設(shè)備選擇最大電壓需要的附件設(shè)備等電聚焦的時(shí)間*MultiphorⅡ3500V?Immobiline干膠條再泡脹盤Immobiline干膠條套件（圖1）EPS 3501 XL電源MultiTemp Ⅲ 恒溫循環(huán)水浴272小時(shí)IPGphor8000VEttan IPGphor固定長度膠條槽,724 cm杯上樣電泳槽724 cm再泡脹盤236小時(shí)* 最佳的聚焦時(shí)間依賴于IPG膠條的長度和pH值的范圍，以及樣品的特性。? 出于安全原因，更高電壓的是不可取的。表3提供了合適于第二向電泳的設(shè)備及膠的大小和于之相匹配的IPG膠條的長度，進(jìn)一步的考慮因素在下面將討論。預(yù)制的ExcelGel凝膠產(chǎn)品提供了可用的凝膠和緩沖膠條。224。因此在進(jìn)行微量預(yù)分離中，往往利用較厚的垂直第二向凝膠。若在進(jìn)行第一向電泳中，使用pH值范圍為6—11的IPG膠條，一般不建議使用Multiphor II設(shè)備進(jìn)行第二向電泳。為了盡快得到結(jié)果，建議使用微型凝膠（MiniGel）電泳儀器——Hoefer miniVE（圖4）或SE—260。如果要快速取得粗略的蛋白質(zhì)情況或當(dāng)樣品中只有幾種不同蛋白時(shí)，使用微型凝膠進(jìn)行第二向電泳是可取的。Hoefer SE260同時(shí)能容納4塊16cm長的凝膠。使用14cm寬度的凝膠，標(biāo)準(zhǔn)的墊片寬度為2cm。為了得到最好的分辨率、重復(fù)性和提高樣品容量，建議使用Ettan DALTtwelve系統(tǒng)（圖 6）。一個(gè)內(nèi)置的珀?duì)柼麥乜睾途彌_液循環(huán)泵能提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境和對溫度精確的控制。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)224。使用手套能減少污染產(chǎn)生的雜點(diǎn)和條帶。將所有的器件用清洗玻璃器皿的去污劑清洗，并且用大量的蒸餾水沖洗。經(jīng)常使用高純度的試劑及蒸餾水。例如，丙烯酰胺是神經(jīng)性毒劑，且有可能致癌。在開始本手冊中介紹的實(shí)驗(yàn)之前，你應(yīng)當(dāng)預(yù)先閱讀該表。有毒物質(zhì)的稱量應(yīng)該戴一次性防塵面罩在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。由于樣品和原始材料的種類繁多，在這里只對樣品制備的一般方法進(jìn)行介紹。若樣品制備能使樣品中的蛋白質(zhì)完全地溶解、分離、變性以及還原，那是最理想的。是否最終結(jié)果要盡可能看到更多的蛋白質(zhì)，還是僅僅想看到樣品中感興趣的蛋白質(zhì)。在這里應(yīng)充分考慮提高樣品質(zhì)量和對樣品進(jìn)行完全的蛋白質(zhì)預(yù)處理之間的相互關(guān)系。溶解不同種類的蛋白樣品應(yīng)采用不同的條件和措施：一些蛋白質(zhì)在天然條件下與膜、核酸及其它蛋白質(zhì)形成復(fù)合物；一些蛋白質(zhì)形成各種非特異性的集合體；一些蛋白質(zhì)條件變化時(shí)就會沉淀。在處理某種樣品的時(shí)候，如果這些步驟中的任何一步?jīng)]有充分完成，分離可能不完全或失敗，并且，一些信息也可能丟失。細(xì)胞破碎方法的選擇，依賴于樣品是來源于細(xì)胞、堅(jiān)硬組織還是其它生物材料以及是否要分析細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)或僅僅是細(xì)胞內(nèi)的一小部分蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的水解增加了雙向電泳結(jié)果分析的難度，因此在細(xì)胞破碎和隨后的預(yù)處理中，樣品必須防止被水解。如果只對組織或細(xì)胞中的一部分蛋白感興趣，在樣品制備過程中可以采取預(yù)先分流的方法。在進(jìn)行雙向電泳之前，樣品可以在不同的提取條件下利用溶解性進(jìn)行預(yù)分。文獻(xiàn)(10)有對蛋白質(zhì)預(yù)分的全面介紹。是否采用這兩步依賴于樣品的自然特性和實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果。它可被用來減少來自樣品的污染。通常對樣品的處理越簡單越好，舉例來說，低蛋白質(zhì)濃度高鹽濃度的樣品能按常規(guī)的方法稀釋和分析；或除鹽，然后利用凍干的方法將其濃縮；或利用TCA和預(yù)冷的丙酮將其沉淀，然后用再水化溶液將其再溶。若蛋白質(zhì)濃縮存在問題或干擾物質(zhì)干擾問題不能克服，有必要使用蛋白質(zhì)沉淀和除雜技術(shù)。通常，高濃度的尿素和一種或多種去污劑同時(shí)使用。 使樣品處理的方法盡量簡單、盡量避免蛋白質(zhì)丟失。224。細(xì)胞破碎有可能的話可在低溫進(jìn)行，并且減少破碎過程中熱量的產(chǎn)生。224。224。224。★ 為了防止蛋白質(zhì)被修飾，不要在加入尿素時(shí)加熱。提高溫度能使尿素轉(zhuǎn)化為異氰酸酯，它能對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾。 關(guān)于使用IPG膠條而準(zhǔn)備樣品方面更多的資料，見參考文獻(xiàn)1416。細(xì)胞破碎必須在低溫下進(jìn)行。在細(xì)胞破碎過程中蛋白酶有可能被釋放出來，因此，蛋白樣品能防止被水解（）。這樣能使蛋白水解酶迅速失活，并且也能使其它一些修飾蛋白的反應(yīng)抑制。參考文獻(xiàn)17和18包含了常規(guī)組織破碎和細(xì)胞裂解方面一般信息。表4. 溫和裂解方法細(xì)胞破碎的方法適用材料一般過程滲透裂解這是一種非常溫和的方法，非常適用于被裂解樣品破碎成亞細(xì)胞成分。凍融裂解許多種類的細(xì)胞通過對其進(jìn)行一次或反復(fù)地快速凍結(jié)再融化的方法來裂解。如果需要，可反復(fù)進(jìn)行。組織培養(yǎng)細(xì)胞將細(xì)胞懸浮在含有去污劑的裂解液中。參照附錄溶液A，是常用的裂解液的配方。 將裂解的樣品在含有過量的非離子或兼性去污劑的溶液中稀釋。 利用丙酮沉淀法,使SDS從樣品中除去。這種方法的進(jìn)行要有一種能降解被降解細(xì)胞的細(xì)胞壁的酶（如溶菌酶用于細(xì)菌細(xì)胞；纖維素酶和果膠酶用于植物細(xì)胞）。當(dāng)只有一種特定的亞細(xì)胞成分（細(xì)胞內(nèi)成分）要分析時(shí)，也可以用溫和的裂解方法。有時(shí)這些方法混合使用(如酶處理后再滲透裂解，在去污劑存在的條件下凍融)。劇烈的破碎法能徹底的破碎細(xì)胞，但是要避免在此過程中產(chǎn)生熱量和泡沫。當(dāng)達(dá)到最大的振幅時(shí)，剪切也越完全，但必須注意減少熱量的產(chǎn)生和泡沫的形成。高壓法(23 ,24, 27)在高壓情況下通過小孔對細(xì)胞施加壓力產(chǎn)生的剪切力破碎細(xì)胞。研磨法(5, 8, 28, 29)一些類型細(xì)胞將它們放在研缽中利用研杵手工將它們破碎。機(jī)械勻槳法(9, 19, 3032)許多裝置能用來進(jìn)行勻槳組織。攪拌器或其它的電動的裝置能用來處理大量樣品。固體組織如果需要，將組織切碎，加入預(yù)冷的勻槳緩沖液(組織的520倍)，迅速進(jìn)行粉碎。滾珠粉碎法(23, 24, 33)旋轉(zhuǎn)玻璃球的摩擦作用能破壞細(xì)胞壁，并釋放細(xì)胞的內(nèi)含物。每克濕細(xì)胞中加入13克預(yù)冷的玻璃珠，旋轉(zhuǎn)液體一分鐘并且在冰上冷卻一分鐘，這樣重復(fù)24次。在蛋白質(zhì)變性過程中，伴隨著蛋白水解作用，使雙向電泳最后結(jié)果復(fù)雜化，因此，必須采用一些方法來避免這些問題。在低溫的時(shí)候，蛋白酶的活性低，因此，建議在樣品制備時(shí)盡可能地在低溫下進(jìn)行。單獨(dú)使用這些方法來抑制蛋白水解已足夠了，然而有些蛋白酶甚至在這些條件下仍然保持著活性，在這種情況下應(yīng)當(dāng)使用蛋白酶抑制劑。表6提供了常用的抑制劑及抑制的蛋白酶。表6. 蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑有效的抑制的酶缺點(diǎn)PMSF很常用的抑制劑，使用濃度為1mM。■ 一些半胱氨酸水解酶。PMSF在含有巰基試劑（DTT或2巰基乙醇）時(shí)效果不好。PMSF毒性相當(dāng)大。AEBSF在抑制活性上與PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低。1mM EDTA,1mM EGTA通常在1mM濃度使用?！?在有DTT存在下作用。使用濃度220μg/ml。抑肽素（Pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶。苯丁抑制劑（Bestatin）能抑制氨基酸多肽酶。多肽蛋白酶抑制劑是小分子多肽，因此有可能在雙向電泳結(jié)果中出現(xiàn)，根據(jù)其分子大小范圍被第二向凝膠分離。TLCK,TPCK(對甲苯磺?；嚢彼崧燃谆? 苯磺酰基賴氨酸氯甲基酮)。芐脒（Benzamidine）使用濃度13mM。 蛋白質(zhì)沉淀進(jìn)行雙向電泳過程中，蛋白質(zhì)沉淀是可選的步驟。此后再將沉淀物溶在樣品液中。沒有一種沉淀方法是十全十美的，有時(shí)一些蛋白質(zhì)沉淀后不能在隨后的樣品重新溶中溶解。如果雙向電泳想要完全和精確地得到樣品中的蛋白質(zhì)，避免使用沉淀和重溶的方法。若在樣品處理中要使用蛋白質(zhì)沉淀方法，一般只用一種沉淀方法。表7. 蛋白沉淀沉淀方法一般過程缺點(diǎn)硫酸銨沉淀法在存在高濃度鹽時(shí)，蛋白質(zhì)有可能結(jié)合起來并從溶液中沉淀出來，許多種潛在的污染物（核酸）將會留在溶液中。慢慢地將硫酸銨加至需要的百分飽度，并且攪拌1030分鐘，利用離心將蛋白質(zhì)分離。然而它可以用來進(jìn)行預(yù)分離和蛋白質(zhì)富集。TCA沉淀TCA是一種相當(dāng)有效的蛋白質(zhì)沉淀劑。也可以將組織直接在1020%的TCA中粉碎，這種方法可以限制蛋白質(zhì)水解和其它蛋白修飾作用，離心并用丙酮或乙醇洗去殘留的TCA。用丙酮或乙醇將殘留的TCA充分洗凈。丙酮沉淀法這種有機(jī)溶劑常用來沉淀蛋白質(zhì)。在提取物中加入3倍體積的預(yù)冷丙酮，使蛋白質(zhì)在20℃條件下沉淀2小時(shí)。TCA的丙酮溶液沉淀蛋白在雙向電泳樣品制備過程中 ，往往用TCA和丙酮的混合物來沉淀蛋白，這種方法比單獨(dú)使用TCA或丙酮效果好。在20℃條件下沉淀蛋白質(zhì)至少45分鐘，用離心方法收集蛋白沉淀，%巰基乙醇或20 mMDTT的預(yù)冷丙酮溶液清洗。蛋白質(zhì)可能很難重新溶解或完全不能重溶。乙酸銨的甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)并且用酚抽提這種方法在處理含有大量干擾物質(zhì)的植物樣品中被證明是有用的。這種方法很復(fù)雜并很費(fèi)時(shí)。因此，樣品制備時(shí)可包含幾步來除去這些雜質(zhì)。參考文獻(xiàn)15 對去除干擾物質(zhì)有進(jìn)一步探討。IPG膠條中的鹽能增加膠條的電導(dǎo)。在膠條中的鹽能引起膠條兩端很大一塊區(qū)域內(nèi)蛋白沒有聚焦（在最終的結(jié)果中表現(xiàn)為水平拖尾或空白）。若樣品在樣品杯中加樣，在樣品中高達(dá)50mM的鹽濃度是可以容忍的，然而，由于蛋白質(zhì)迅速向低鹽濃度的區(qū)域移動，在樣品加樣點(diǎn)蛋白質(zhì)有可能發(fā)生沉淀。然而，這過程需要大量時(shí)間并且需要樣品體積較大。旋轉(zhuǎn)透析法應(yīng)該在加尿素和去污劑前進(jìn)行。 沉淀/重懸法是除去鹽和其它污染物相當(dāng)有效的方法，但它也會產(chǎn)生蛋白丟失。這些物質(zhì)往往帶有負(fù)電荷，在正極端能引起蛋白聚焦不完全。離子去污劑離子去污劑（通常是SDS）常常在蛋白質(zhì)提取和溶解過程中使用，但是對等電聚焦的影響特別大，除非SDS除去或?qū)DS分離。在含有兩性電解質(zhì)或非離子去污劑（CHAPS、Tritonx100或NP40）%或更低，并且使其它的去污劑和SDS的比例為8:1［27］。在室溫下沉淀能除去SDS最有效但蛋白在20℃沉淀更徹底。高分子量的核酸能堵塞凝膠孔隙。若將分離的樣品用銀染，核酸也能被染色，這樣在第二向膠產(chǎn)生背景污染。、冰上孵育。超離心技術(shù)能將大分子的核酸除去，然而這種方法也能使大分子量的蛋白質(zhì)除去。強(qiáng)離子強(qiáng)度或高pH值的提取液能減少這種反應(yīng)（注意在提取過程中加入的鹽必需隨后除去）。一些帶負(fù)電的多糖可和蛋白通過靜電作用結(jié)合。超離心會除去高分子量多糖。脂類（lipids）許多種蛋白質(zhì)，尤其是膜蛋白能與脂類結(jié)合，這樣既降低可溶性又能影響pH值和分子量。當(dāng)將富脂組織離心后，常見到一層脂質(zhì)層，很難被除去。需要過量的去污劑。酚類化合物(Phenolic Compounds)酚類化合物存在于植物組織中，能通過酶催化氧化反應(yīng)修飾蛋白質(zhì)（43, 49）。利用沉淀技術(shù)能迅速將蛋白質(zhì)從酚類化合物中分開。利用PVP或PVPP吸附劑的吸附將酚類化合物除去。使用樣品杯加樣時(shí)，不溶物質(zhì)尤其是個(gè)問題，它能阻礙蛋白質(zhì)進(jìn)入IPG膠條。 樣品溶液的組成為了取得良好聚焦的第一向分離，樣品蛋白必須充分解聚，并完全溶解。這往往包括尿素以及一種或多種去污染劑。還原劑和IPG緩沖溶液經(jīng)常被加入到樣品溶液中，以提高樣品的溶解度。尿素是一種中性的促溶劑，在雙向電泳的第一向中被用作變性劑。尿素能使許多種蛋白溶解并展開來形成完全隨機(jī)的結(jié)構(gòu)，所有的離子基團(tuán)暴露在溶液中。為了確保樣品的完全溶解和防止通過疏水反應(yīng)而使蛋白質(zhì)相互結(jié)合，在樣品溶液中往往包含非離子或兼性離子去污劑。后來的研究證明，兼性去污劑CHAPS的效果更好(57)。當(dāng)使樣品完全溶解發(fā)生困難時(shí)，陰離子去污劑SDS能被用做促溶劑。普遍使用的去除SDS干擾的方法是將樣品在含有過量的CHAPS 、Triton X100或NP40的溶液中稀釋。為了打斷二硫鍵，并且使所有蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)，在樣品溶液中往往加入還原劑。DTE與DTT相近，也能用作還原劑。最近，非巰基還原劑TBP（Tributyl phosphine）被用作