單克隆抗體ppt課件-在線瀏覽
2025-06-23 13:10本頁面
【正文】 作量大、難度高，在制備人用單抗時比較有用。 ? 單克隆抗體的特點是：理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強，廣泛應(yīng)用于生物學和醫(yī)學研究領(lǐng)域： ? ? ? ? ? ： ? 完全抗原：病毒、細菌、真菌等微生物和蛋白質(zhì)等分子量大于 5000Da生物物質(zhì) ? 半抗原：多糖、藥物、激素、肽類等分子量小于 5000 Da 物質(zhì) ? 半抗原需與 BSA、 OA等載體交聯(lián)后成完全抗原才能刺激動物產(chǎn)生可應(yīng)用的高效價的抗體 脾臟細胞獲得 ? 1) 小白鼠 (BALB/c) 先以目標抗原 (如菌體 ) 免疫， 2) 抗原需加 佐劑 (adjuvant, 如 TiterMax) 制成乳劑，3) 打入小鼠體內(nèi)慢慢釋出 (免疫流程 )， 4) 誘使 B 細胞成熟增殖并生產(chǎn)抗體， 5) 然后取出脾細胞 (大多為 B 細胞 ) 。 也可以在 電泳后 ， 切出所要色帶，膠體裝入乳化針筒，加入佐劑 直接制成乳劑，可有相當好的免疫效果 。 近來更流行以抗原的 DNA 種入肝臟中，以此 DNA 的表現(xiàn)產(chǎn)物，直接在生物體內(nèi)誘發(fā)免疫反應(yīng)。 ? 4）注意免疫過的脾臟 被大量結(jié)締組織包裹 ,分離起來比正常脾臟困難一些，如果不能完整的分離，可以分小塊分離。換一套小剪刀和鑷子，用小鑷子夾緊脾臟并輕輕向上提起，用小剪刀剪斷結(jié)締組織即可分離出脾臟，之后，用小剪刀在脾臟的邊緣剪一些小口，將脾臟轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中。 ? 骨髓瘤細胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣 雜交融合率高。 ? 一般在準備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細 胞。 骨髓瘤細胞懸液的制備方法（一）： 細胞培養(yǎng)法 a、于融合前 4836小時，將骨髓細胞擴大培養(yǎng)（一般按一塊 96孔板的融合試驗約需 23瓶 100ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細胞進行準備）。 c、 1000r/min離心 510分鐘，棄去上清。然后將細胞重懸浮于 10ml不完全培養(yǎng)基，混勻。細胞計數(shù)時，取細胞懸液 臺盼藍染液中，混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)。 ? ⑵在一支滅菌 50mL離心管中事先加入 15mL淋巴細胞分離液。取 15mL骨髓瘤細胞懸液輕輕加到淋巴細胞分離液的上層。 ? ⑸用 10mLRPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸骨髓瘤細胞，用血球計數(shù)板計數(shù)。同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌 2次。 于超凈工作臺內(nèi)取出滅菌的吸水紙，將裝有骨髓瘤細胞與免疫睥細胞混合細胞的 50mL離心管上清倒盡后，倒扣在吸水紙上控干水滴（很重要）。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止 PEG作用。 ? 融合條件： PEG1450, 90秒，濃度 50% ? （ 4）離心，棄上清，用 20％小牛血清的 HAT培養(yǎng)液輕輕混懸。 5. 融合細胞的篩選 融合后的細胞類型 ? 融合的脾細胞和瘤細胞、 融合的脾細胞和脾細胞 、 融合的瘤細胞和瘤細胞 、 未融合的脾細胞 、 未融合的瘤細胞 以及 細胞的多聚體 等。 ? 剩余：脾細胞與瘤細胞的融合細胞 +未融合的瘤細胞 +融合的瘤細胞和瘤細胞 ，其中后兩種需進行特別的篩選去除。 篩選原理 ? DNA的合成 ： ? 正常途徑 ： 糖、氨基酸 —— 核苷酸 —— DNA ，可以被 氨基蝶呤（ A） 阻斷 ? 胸腺嘧啶核苷激酶（ TK） ? 補救途徑 ： 核苷酸前體 —— 核苷酸 —— DNA 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 （ HPRT） 需要 2種酶的共同參與； 氨基蝶呤 對補救途徑無阻斷 ? （ 1）氨基蝶呤可阻斷細胞正常途徑合成 DNA，因此 HAT培養(yǎng)基上的細胞不能采用該途徑合成 DNA。 ? 兩條途徑被阻斷后，有怎樣的結(jié)果呢？ ? 瘤細胞（未融合的和多聚體）命運：因不能正常合成DNA而死亡 。 ? 1 集落孔的標記 融合后第 7天，在倒置顯微鏡下對培養(yǎng)板進行觀察，在有集落出現(xiàn)孔的培養(yǎng)板蓋上方用記號筆打上小點，標明集落的位置，以便檢測時取樣以及原始孔的對號入座。 ? ELISA方法一步篩選即可；而不完全抗原篩選分兩步進行，第一步為間接ELISA法篩選，本步篩選出抗半抗原而不抗載體（ BSA、 HSA）的陽性孔；第二步為直接競爭ELISA法篩選，此步對第一步篩選出的陽性孔進行檢測，篩選出 B/B0值相對較小的孔。 ? 在
教學課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1