【正文】 A錯配的堿基對。 故現(xiàn)在又稱為 DNA錯配修復基因。 36 結(jié)腸癌的 mutator gene E． coli 人 染色體的位置 %HNPCC Muts MSH2 2P15P22 5060% Mutl MLH1 3040% Mutl PMS1 2p31p33 5% Mutl PMS2 7p22 5% 與 TSG一樣，這類基因突變是隱性的，亦需要兩次打擊機制。 Mut H ? 該系統(tǒng)的修復機制主要依賴于 Mut S 、 MutL、 MutH， 基因所編碼的蛋白、酶分子來完成。 ? 而后 MutL 和 MutH基因產(chǎn)物依次與 MutS形成復合物 進行協(xié)同作用。 41 人類 MMR系統(tǒng)： ? 現(xiàn)已闡明，人類 MMR基因編碼的錯配修復蛋白可相互作用，形成一種多聚復合物，參與細胞錯配修復反應(yīng)。 ②消除： 消除由于簡單重復序列之間的 遺傳重組出現(xiàn)的不配對基堿序列。 人體細胞中 DNA 錯配修復反應(yīng)過程依賴于幾種人類 MMR基因產(chǎn)物 . ? 因此，其中任何一種基因發(fā)生突變導致其產(chǎn)物的功能喪失，將造成 DNA錯配，修復功能的異常、缺陷、或喪失。 DNA MMR系統(tǒng) Gene 突變 MMR系統(tǒng)缺陷 修復功能下降 MI 腫瘤易感性增強 45 微衛(wèi)星不穩(wěn)定（ MI） ? （ Microsatellite DNA instability,MI） 是指 T組織和 N組織相比，其 DNA等位結(jié)構(gòu)發(fā)生簡單重復序列的改變，這種改變表現(xiàn)在腫瘤組織與其對應(yīng)的正常組織 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，電泳帶出現(xiàn)增加或減少、位置及帶的密度變化 。例如 ： 在家族性遺傳性非息肉型結(jié)腸癌（ HNPCC）形成過程 ? 第一次突變（生殖 C ） MMR Gene突變 ，個體對結(jié)腸癌易 患 傾向 ? 第二次突變（體 C）另一等位基因突變 純合子 功能喪失 原癌基因、抑癌基因突變快速積累 細胞增殖失調(diào) ? 74例 HNPCC家系中研究表明，復制差（ RER） 陽性率高達 92%,說明 MMR Gene 發(fā)生突變。近年來研究發(fā)現(xiàn)，存在著促進轉(zhuǎn)移的 腫瘤轉(zhuǎn)移基因（ Tumor metastasis gene）和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因（ Tumor metastasis suppressor gene） . 48 從分子水平看，轉(zhuǎn)移分為三步： 1)黏附， 腫瘤細胞與胞外基質(zhì)中的層粘連蛋白和纖維連接蛋白相黏附； 2）降解， 腫瘤細胞釋放各種水解酶破壞黏附組織； 3）移動， 腫瘤細胞向縱深移動播散。 ? 轉(zhuǎn)移促進基因： 基因表達促進腫瘤轉(zhuǎn)移。 編碼 Ca2+ 結(jié)合蛋白 ,促進 C運動，影響細胞與細胞外基質(zhì)粘附，改變蛋白水解活性促進轉(zhuǎn)移。 ? MTA1基因與乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。表達降低與人類的某些腫瘤轉(zhuǎn)移力增強有關(guān)。 ? KISS基因， 1977年 ， Lee,在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)。 ? KAI基因（ cd82）， 在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)，定位于 ,編碼 267個氨基酸。 5q21APC 一個拷貝丟失 — 產(chǎn)生腺瘤樣息肉， APC的丟失或突變其早期事件。 約 50%晚期腺瘤與癌有 18q雜合丟失（這在早期、中期腺瘤是不常見的）。 直腸癌有高頻率的 p53的突變。 56 六、研究熱點 端粒和端粒酶 ? 端粒（ telomere）： 是真核細胞染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由端粒 DNA和蛋白質(zhì)組成。對染色體具有保護作用。他們的研究成果揭 示端粒變短，細胞就老化 。 伊麗莎白 布萊克本 卡蘿爾 格雷德 杰克 紹斯塔克 58 ? 不同物種的端粒 DNA 序列并不一致，人和其它哺乳動物的端粒 DNA序列由 5ˊ —— 3ˊ 方向的（ TTAGGG） n反復串聯(lián)組成。 ? 端粒 DNA的 3ˊ 末端較 5ˊ 末端伸出 12～ 16bp 的一段彎曲呈帽狀結(jié)構(gòu)，保護染色體，防止斷裂、重組或降解，促進染色體與核膜粘著，以及減數(shù)分裂時同源染色體配對。端粒的序列長度代表著一個細胞的壽命。當其長度減小到一定臨界值時，細胞趨向衰老、死亡。 60 端粒 DNA 逐漸變短的主要原因： ? 細胞分裂過程中線形染色體的末端端粒DNA不能完全被 DNA指導 DNA多聚酶所復制； ? 末端的特異性和非特異性降解； ? 細胞異源端粒之間的不均勻重組。 ? 端粒酶（ telomerase）： ? 是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，能延長端粒末端， 由蛋白質(zhì)和 RNA 組成 ，可以其 RNA為模板指導 DNA合成，向端粒末端添加（ TTAGGG） n序列，使端粒延長，延長細胞的壽命甚至使其永生化。 在 G2期 /M期 端粒酶活性逐漸消失。但在腫瘤細胞、永生型細胞及干細胞（如造血干細胞）中，端粒酶可被激活，活性增強。 ? 細胞永生化是癌癥的共同特征。但是，細胞偶爾發(fā)生突變而重新 激活端粒酶 ，這樣當細胞分裂時端粒就變長而不是縮短。 端粒酶與腫瘤 ? 這種突變本身并不足以導致癌癥產(chǎn)生。 ? 令人感興趣的是，即便在癌細胞中，端粒也不會無限制地變長。 ? 但是這里就存在一個問題：是什么阻止端粒無限制變長？ ? 瑞士 Joachim Lingner教授 給出這個問題的答案：他們鑒定出三個蛋白連接在一起而形成一種蛋白復合物，然后附著到端粒上。但是在癌細胞中，它們的作用時間不對，即它們參與的時間太晚了?！边@樣，癌細胞就能夠像正常細胞那樣死亡。 ? Ueda報道（ 1997， Cancer Res.），在惡性腫瘤中 91%端粒酶活性增強。 69 上述情況表明，絕大多數(shù)腫瘤細胞中都呈端粒酶陽性，而在正常組織中卻無表達。 ? Hiyama E （ 1997， CancerRes），通過檢測胰腺腫瘤得出： 95%胰腺癌中端粒酶活性增強，而在良性胰腺瘤中為 0%。 70 研究者們建議利用端粒酶抑制劑進行腫瘤治療。 ? Kanazawa 制備一種錘頭核酸酶 telorz，作用于人類端粒酶的 RNA成分，對已合成的端粒酶 RNA成分具有特異分解作用，對端粒酶有明顯的抑制作用。 71 核酶 Ribozyme 72 核酶 73 RNA干擾 ? 近年來的研究表明 ? 將與 mRNA對應(yīng)的正義 RNA和反義 RNA組成的雙鏈 RNA(dsRNA)導入細胞，可以使 mRNA發(fā)生特異性的降解，導致其相應(yīng)的基因沉默。 74 75 GFP報告基因 RNAi 76 RNAi機制 77 78 79 RNA干擾 05/11/18 cell wangxiaodong 80 RNAi的分子機制 ? RNA干擾包括 起始階段和效應(yīng)階段 (inititation and effector steps)。 ? 證據(jù)表明；一個稱為 Dicer的酶，是 RNase III家族中特異識別雙鏈 RNA的一員，它能以一種 ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈 RNA，將 RNA降解為2123bp的雙鏈 RNAs(siRNAs)，每個片段的 3’端都有 2個堿基突出。 ? 激活 RISC需要一個 ATP依賴的將小分子 RNA解雙鏈的過程。 ? 盡管切割的確切機制尚不明了，但每個 RISC都包含一個 siRNA和一個不同于 Dicer的 RNA酶 (Ago2) 83 如何進行 RNAi試驗 (一 )siRNA的設(shè)計 在設(shè)計 RNAi實驗時，可以先在以下網(wǎng)站進行目標序列的篩選： tm tml x?SID=45358710 84 (二 )siRNA的制備 公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學合成 siRNA。 RNase III 消化長片斷雙鏈 RNA制備 siRNA dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的。 5. siRNA表達框架 siRNA表達框架 (siRNA expression cassettes， SECs)是一種由 PCR得到的 siRNA表達模版，包括一個 RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu) siRNA，一個 RNA pol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。磷酸鈣 DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質(zhì)。將細胞懸浮液置于電場中會誘導沿細胞膜的電壓差異，據(jù)認為這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。通過使用 DMSO或甘油獲得的滲透休克將 DNA復合體導入。 形成 DNA陽離子脂質(zhì)體復合物。 89 ? 1. 研究基因功能的新工具 ? 已有研究表明 RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來 RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日