【正文】 　　,只需要離心和真空抽干,這個系統(tǒng)可以從500ml培養(yǎng)液中在3小時以內(nèi)獲得1mg以上的高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(20020000bp)。 　　2. 加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。 　　1真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。 　　1取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分鐘。 　　加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘?！　?℃下5000g離心15分鐘。 　　加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴10分鐘。 　　同步驟1方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。 　?。ㄒ唬A法 　　取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的含pBS質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液250ml，4℃下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡?！　∪?、質(zhì)粒DNA的大量提取和純化 　　在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。 　　1丟棄微型柱，將eppendorf管中的質(zhì)粒DNA貯于4℃或20℃冰箱。 　　取出微型柱置于eppendorf管中,離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。 　　取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進(jìn)入微型柱。 　　4℃下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。 　　 加200μl 細(xì)胞裂解液, 顛倒離心管數(shù)次,直到溶液變清亮。 　　 13ml過夜培養(yǎng)細(xì)胞液4℃下 12000g離心12分鐘。提取的質(zhì)?？芍苯佑糜贒NA測序、酶切分析和體外轉(zhuǎn)錄等。沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積),且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來,所以多數(shù)還是用乙醇。 　　2. 提取質(zhì)粒DNA過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。 　　將沉淀溶于20μl TE緩沖液(，含20μg /ml RNaseA)中，儲于20℃冰箱中。 　　棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心510分鐘。 　　上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。 　　加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。 　　棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。 　　3. 提取的質(zhì)粒DNA中會含有RNA,但RNA并不干擾進(jìn)一步實驗,如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應(yīng)等?！　?. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時,細(xì)菌裂解效果反而不好。 　　取20ml進(jìn)行電泳檢查。 　　用微量離心機(jī)4℃下12000g離心10分鐘。 　　加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3秒鐘。 　　棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期。 （2）上樣緩沖液 (6)：% 溴酚藍(lán)，40% (w/v) 蔗糖水溶液。Cl()，1mmol/L EDTA ()。Cl()，10 mmol/L EDTA ()， 5% Triton X100。高壓滅菌后儲存于4℃冰箱中。 　　1 TE緩沖液：10 mmo/L Tris 　　按體積/體積＝1:1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。 　　1 氯仿:按氯仿:異戊醇＝24:1體積比加入異戊醇。Cl () 　　飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物,這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián),應(yīng)在160℃用冷凝管進(jìn)行重蒸。Cl(), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加熱15分鐘,使混有的DNA酶失活。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。　　溶液Ⅱ： mol/L NaOH (臨用前用10mol/L NaOH母液稀釋)，1％ SDS。 　　 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L ()， 10mmol/L EDTA ()。　　 3mol/l NaAc ()： NaAc 　　 溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris　　LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉,高壓滅菌。 　　二、設(shè)備 　　微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 臺式高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床， 高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)， 渦旋振蕩器， 電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和 恒溫水浴鍋等。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時,同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時，細(xì)菌的線性染色體DNA變性,而共價閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X100可使細(xì)胞膜裂解?！　募?xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞。 依據(jù)功能載體可分為克隆載體喝表達(dá)載體兩類。 載體由多種不同的部分組成，如復(fù)制子，啟動子和抗性基因等。 作為基因工程所用克隆載體，必須具備以下條件：（1）復(fù)制子（replicon），這是具有特殊結(jié)構(gòu)的序列，載體有復(fù)制起點才能使位于其上的外源基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制和增殖；（2）有一個或多個便于檢測的遺傳標(biāo)記（乳抗生素的抗性，營養(yǎng)缺陷性喝顯色反應(yīng)等）；（3）在肥必須區(qū)內(nèi)的DNA片段內(nèi)有較多的單一限制性內(nèi)切酶酶切位點，便于母的基因的克?。?。一個理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點；（3）能插入較大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的檢測表型。與天然質(zhì)粒相比,質(zhì)粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的多克隆位點序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因,其表型包括對抗生素的抗性,產(chǎn)生某些抗生素,降解復(fù)雜有機(jī)物,產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶等。當(dāng)細(xì)胞生長幾代后,占少數(shù)的質(zhì)粒將會丟失,因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性(Inpatibility)。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素時,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制,緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止,而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制,質(zhì)?？截悢?shù)可由原來20多個擴(kuò)增至10003000個,此時質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來的2%增加至4050%。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時,它也不能復(fù)制,通常每個細(xì)胞內(nèi)只含有1個或幾個質(zhì)粒分子,如F因子。F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質(zhì)粒。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。 　　質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。 第一章 質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定 第一節(jié) 概 述 　　把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù),送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體(Vector)。細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。 　　質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxed control)。后者的質(zhì)粒在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制,在每個細(xì)胞中有許多拷貝,一般在20個以上,如Col E1質(zhì)粒?！　±猛粡?fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在,當(dāng)兩種質(zhì)粒同時導(dǎo)入同一細(xì)胞時,它們在復(fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中彼此競爭,在一些細(xì)胞中,一種質(zhì)粒占優(yōu)勢,而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。但利用不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細(xì)胞中?！　≠|(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實驗室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR32PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。（4）具備適當(dāng)?shù)目截悢?shù)；（5）具有較高的遺傳穩(wěn)定性。按照基本組成元件來源不同，又可以將載體分為質(zhì)粒載體，噬菌體載體，病毒載體，黏粒載體喝人工染色體載體等多種類型。克隆載體用于在宿主細(xì)胞中克隆和擴(kuò)增外源片段；表達(dá)載體則用于在宿主細(xì)胞中獲得外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。分離和純化質(zhì)粒DNA。經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton X100處理后,細(xì)菌染色體DNA會纏繞附著在細(xì)胞碎片上,同時由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。 在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA(Open circular DNA, 簡稱 ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(Linear DNA)。 第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑 　　一、材料 　　含pBS的E. coli DH5α或JM系列菌株，(又稱eppendorf管),離心管架?！　∪⒃噭?　　 LB液體培養(yǎng)基(LuriaBertani) ：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去離子水中，, 加去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。 　　 氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, 20℃保存?zhèn)溆谩l()溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份()保存于20℃,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。3H2 O, 加水定容至100ml, 分裝后高壓滅菌,儲存于4℃冰箱。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱。 　　溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 ， H2O ，定容至100ml, 并高壓滅菌。 　　RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/L Tris eppendorf管分裝成小份保存于20℃。％的8羥基喹啉(作為抗氧化劑),Cl(),因為酸性條件下DNA會分配于有機(jī)相。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時應(yīng)戴手套。Cl ()，1 mmol/L EDTA ()。　　1STET： mol/L NaCl，10mmol/L Tris　　1STE：，10mmol/L Tris 　　1 電泳所用試劑： （1） TBE 緩沖液 (5)：稱取 Tris 54g，并加入 EDTA () 20ml，定溶至1000ml。 第三節(jié) 操作步驟 　　一、 細(xì)菌的培養(yǎng)和收集 　　將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養(yǎng)1224小時。 　　二、 質(zhì)粒DNA少量快速提取 　　質(zhì)粒DNA小量提取法對于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。　?。ㄒ唬⒅蠓蟹?　　,4℃下12000ｇ離心30秒。 　　將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻?！　ppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出?！　∮脽o菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。 　　[注意] 1. 對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。有時不同溶菌酶也能溶菌?！　。ǘ?、 堿法 　　 eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。 　　菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置510分鐘。 　　加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中510分鐘,4℃下12000g離心510分鐘。 　　將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。 　　吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥?！　注意] 1. 提取過程應(yīng)盡量保持低溫。 　　3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完全。 　　（三）、Wizard少量 DNA 純化系統(tǒng) 　　Promega公司的Wizard少量DNA純化系統(tǒng)可快速有效的抽提質(zhì)粒DNA,整個過程只需15分鐘。