【正文】 ??????6第五節(jié) 常用緩沖液、胰蛋白酶消化液及培養(yǎng)基的配制 ??????????????????????????????????????8第六節(jié) 細胞培養(yǎng)、換液、消化傳代 ????????????????????????????????????????????????????????????????????11第七節(jié) 細胞計數(shù) ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????14第八節(jié) 細胞復(fù)蘇與凍存 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????16第九節(jié) MTT 法測定細胞活力或細胞增殖 ???????????????????????????????????????????????????????????17第二章 分子實驗操作 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????18第一節(jié) PCR 引物設(shè)計與實驗操作 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????18第二節(jié) WESTERN BLOT 實驗操作 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????26第三節(jié) FLOW CYTOMETRY 實驗操作 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????323 / 32第一章 細胞實驗操作第 1 節(jié) 細胞培養(yǎng)常用耗材與設(shè)備1. 準備室中常見耗材與設(shè)備 去離子水制備器、酸缸、烘箱、高壓滅菌鍋、儲備柜（放置干凈未消毒的物品） 。 容量瓶（500 ml，1L） 、錐形瓶（500 ml，1L） 、磁力攪拌器、pH 計、電子精密天平、臺式離心機、冷凍離心機、渦旋器、普通冰箱（4℃，20℃） 、超低溫冰箱（70 ℃） 。 移液槍（，10μl ， 100μl，200μl，1000μl ，5ml） ，槍頭（10μl ，200μl，1ml；顏色分別為：白，黃，藍） ， eppendorf 管（、） 。 酒精噴壺（裝 75%酒精） ，酒精棉（濃度為 75%） 、純酒精（95%，酒精燈使用）第 2 節(jié) 無菌操作1. 無菌室的打掃與滅菌1) 定期打掃無菌室：先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰新潔爾滅擦拭。 （對于含有自動滅菌程序的孵箱，先用 75%酒精擦拭后，再啟動其滅菌程序）3) 實驗前細胞房與超凈臺的滅菌：打開紫外燈，照射 30min 左右。2. 實驗人員的無菌準備1) 實驗前應(yīng)用肥皂洗手。3) 75%酒精消毒雙手。2) 在通風條件下，先點燃酒精燈，再用酒精棉擦拭超凈臺桌面（盡可能的大于自己所用臺面） ，同時保持工作區(qū)域的寬敞。超凈臺雖經(jīng)紫外照射除菌，但也是相對的，因此，操作時應(yīng)靠近酒精燈火焰。例如，一個右手操作者要從試劑瓶里吸取液體，則移液槍應(yīng)放在右手，而槍頭與試劑瓶都應(yīng)放在左手邊。6) 要養(yǎng)成用鑷子操作的習(xí)慣：拿取飯盒中的各類物品，盡可能用鑷子去夾取；對于小的物品，如瓶蓋、槍頭、eppendorf 管，應(yīng)避免用手直接去拿取。禁止在打開試劑瓶包括瓶蓋的正上方進行實驗操作（包括跨越敞開的開試劑瓶上方去拿取東西） 。9) 廢液的處理：先將廢液缸中的液體倒入下水道，再將廢液缸中其他東西倒入垃圾簍中（盡可能避免將大量廢液倒入垃圾簍中） 。2) 在打開試劑瓶、拿取瓶蓋、鑷子及玻璃移液管等時都要用火燒下：灼燒不是為了滅菌，只需在火焰上燎 1~3 秒即可。3) 定期檢查 CO2 鋼瓶的壓力。2) 烘干，泡酸：烤箱中烘干，浸入洗液（重鉻酸鉀 120g：濃硫酸 200ml：蒸餾水 1000ml，先將重鉻酸鉀溶于水中，待涼，將濃硫酸緩慢倒入其中，邊倒邊攪拌）中，浸泡 12 小時，然后從酸缸里撈出器皿用自來水沖洗15 次，最后蒸餾水沖洗 35 次和用雙蒸水過 3 次。2. 橡膠與塑料制品的清洗橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進行如下的處理程序。用過的濾器，每次用完后及時用自來水、蒸餾水、雙蒸水沖洗干凈，晾干就可。然后再泡入鹽酸液 30 分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。3) .塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板及膠頭：用洗滌劑洗干凈后，用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，涼干。 3. 注意事項1) 注意人體的防護和器皿的完全浸泡：，防止酸液濺起傷害人體。C. 器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。在細胞培養(yǎng)的實驗過程中，有一半以上任務(wù)是培養(yǎng)用品的消毒滅菌。目前本實驗中采用的消毒滅菌方法主要是濕熱消毒、紫外線消毒及過濾除菌消毒。高壓蒸汽滅菌鍋裝置嚴密，輸入蒸汽不外逸，溫度隨蒸汽壓力增高而升高，當壓力增至103~206kPa 時 ，濕度可達 ℃。適用于耐高溫、高壓，不怕潮濕的物品，如敷料、手術(shù)器械、玻璃器皿、培養(yǎng)瓶/皿、細菌培養(yǎng)基等。② 將擬滅菌的物品隨同盛裝的桶放入滅菌器內(nèi)；將蓋子上的排氣軟管插于鋁桶內(nèi)壁的方管中；蓋好蓋子，擰緊元寶螺絲，勿使漏氣。④ 排出鍋內(nèi)冷空氣，關(guān)閉放氣閥（一般以空氣急速排出 2 分鐘左右為7 / 32準） ，使壓力逐漸上升至 120kPa（壓力表中的指針應(yīng)在中間位置左右），調(diào)節(jié)變壓器，維持壓力 30 分鐘左右。⑥ 滅菌鍋壓力降至“0”后，約 10 分鐘，再慢慢打開滅菌鍋蓋子。2) 注意事項：① 滅菌前必須檢查鍋內(nèi)水位。③ 滅菌時，對于螺旋蓋的瓶子，應(yīng)使瓶口半松；對于膠塞的瓶子，應(yīng)插入注射器針頭，保持瓶子內(nèi)的冷空氣順利排出。④ 液體滅菌時，液體體積以不超過 3/4 為宜。3) 不能高壓滅菌的有：① 含有熱不穩(wěn)定組分，如血清、維生素、抗體和蛋白質(zhì)等（如 BSA） 。③ 含 HEPES 的溶液。⑤ 含有二硫蘇糖醇（DTT）或 β巰基乙醇（BME） 。2. 紫外線消毒8 / 32紫外線直接照射消毒是目前實驗室中常用的方法之一，主要用于實驗室房間里的空氣、超凈工作臺、桌椅表面等消毒。3. 過濾除菌消毒對于不宜采用高壓滅菌的液體，如培養(yǎng)基、血清等，可采用過濾方法以去除細菌等微生物。具體采用那種方法，主要依賴于濾液的體積，對于體積較大的，如 1L培養(yǎng)基及緩沖液等，可采用抽濾式裝置，對于體積較小的（ 200ml） ，可采用針孔注射式濾器。第 5 節(jié) 常用緩沖液、胰蛋白酶消化液及培養(yǎng)基的配制平衡鹽溶液是組織細胞培養(yǎng)中常用的基本溶液，用于維持滲透壓，調(diào)節(jié)以及供給細胞生存所需的能量和無機離子成分。各種緩沖液的主要不同點在于 NaCl 的濃度、離子的濃度及緩沖系統(tǒng)的不同。12H2O gKCl gKH2PO4 g注意：在 800ml 雙蒸水中依次溶解上述試劑，調(diào)節(jié) pH 至 ，然后定容至1L。保存：高壓滅菌，4℃保存。12H2O gKCl gKH2PO4 gMgSO4 g葡萄糖 1 gCaCl2 g注意：A： 在 800ml 雙蒸水中依次溶解前六種試劑，為 A 液。C： 在持續(xù)攪拌下，將 B 液緩慢滴加進 A 液（不宜滴加過快，負責會產(chǎn)生沉淀） 。用途：沖洗組織和細胞。3. KRPH 配制（1L）：NaCl gKCl gKH2PO4 gMgSO4 gNaHCO3 gHEPES gCaCl2 g注意：A： 在 800ml 雙蒸水中依次溶解前六種試劑，為 A 液。C： 在持續(xù)攪拌下，將 B 液緩慢滴加進 A 液（不宜滴加過快） 。保存：過濾除菌，4℃保存。本實驗室采用的消化液主要有兩種：%胰蛋白酶消化液、%胰蛋白酶+%EDTA 消化液 。注意，配消化液所用溶液均為無 Ca2+、Mg 2+的緩沖液（如 PBS） 。2) %胰蛋白酶+%EDTA 消化液（100ml ）A： 稱取 的胰蛋白酶，加入 PBS 緩沖液 50ml，攪拌充分溶解；B： 稱取 EDTA, 加入 PBS 緩沖液 50ml，攪拌充分溶解；C： 將混合兩種液體，過濾除菌，4℃保存。每次新配的消化液，應(yīng)對其消化時間進行摸索。我們在實驗室中常用的是干粉培養(yǎng)基，如 RPMI1640，DMEM，M199，MEM，F(xiàn)12 等。1) 配之前，請先仔細閱讀下培養(yǎng)基袋子上的標簽，看哪些物質(zhì)已有，哪些是沒有的，如丙酮酸鈉，谷氨酰胺，NaHCO 3 等，沒有的話，需11 / 32要額外補加。3) 用剪刀將培養(yǎng)基袋剪一個三角口，盡可能一次性將培養(yǎng)基倒入錐形瓶，再用裝雙蒸水的洗瓶將袋子里的培養(yǎng)基沖洗干凈，全部轉(zhuǎn)移到錐形瓶中。5) 用稀鹽酸或 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 左右（過濾時，會升高 ~） 。第 6 節(jié) 細胞培養(yǎng)、換液、消化傳代每個人在第一次接觸一種新的細胞株時，應(yīng)對其細胞形態(tài)