hxy-第四章-目的基因的獲取-展示頁(yè)
2025-05-16 18:09本頁(yè)面
【正文】 胞的 整個(gè)基因組 DNA切割成大小合適的片斷，并將 所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中 保存和擴(kuò)增 。 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ T4DNA連接酶 Klenow片段 引物 1. 直接合成基因 三、 寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn) 2. 合成引物（ 20mer左右） （ 1） mRNA的含量很低，很難作 cDNA 3. 合成探針序列 4. 定點(diǎn)突變合成 合成帶有 定點(diǎn)突變 的基因片斷。 1. 互補(bǔ)連接法 預(yù)先設(shè)計(jì)合成的片斷之間都有 互補(bǔ)區(qū)域 ，不同片斷之間的互補(bǔ)區(qū)域能形成有 斷點(diǎn) 的完整雙鏈。 化學(xué)合成的 DNA片斷一般在 200bp以內(nèi)。 1976年 . Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于 1979年在 science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸 tRNA基因的論文。 （ Sau3A— BamH I） 2. 機(jī)械切割法 （ 1）超聲波 超聲波強(qiáng)烈作用于 DNA，可使其斷裂成約 300bp的隨機(jī)片斷。如 HaeⅢ 、 AluI、 Sau3A。 2） 6bp的內(nèi)切酶 平均每 44（ 256） bp一個(gè)切點(diǎn)。 ① 內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù) 影響所切出的產(chǎn)物的長(zhǎng)度和隨機(jī)程度。 1. 優(yōu)點(diǎn) 2. 缺點(diǎn) 目的基因 內(nèi)部 也可能有該內(nèi)切酶的切點(diǎn)。 大腸桿菌作為寄主進(jìn)行 DNA克隆的實(shí)驗(yàn)方案 DNA片段 的獲得 載體構(gòu)建 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 重組體 的鑒定 限制性內(nèi) 切酶消化 機(jī)械切割 雙鏈 cDNA 的合成 化學(xué)法 直接合成 同聚物 加尾 粘性末端 連接 平末端 連接 加接頭造成 粘性末端 重組噬菌體 DNA轉(zhuǎn)染 重組質(zhì)粒 的轉(zhuǎn)化 體外包裝 進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo) 表型鑒定 核酸雜交 免疫學(xué)分析 酶切鑒定 第一節(jié) 基因組 DNA片斷化 一、限制性內(nèi)切酶法 用限制性內(nèi)切酶把基因組 DNA切成不同大小的片斷。 一般而言，基因克隆包括四部分工作： 目標(biāo) DNA片段的獲得； 克隆載體的構(gòu)建； 寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化； 重組體克隆的選擇和鑒定 。第四章 目的基因的獲取 目的基因： 準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因。 基因克隆的本質(zhì)是把某一目的 DNA片段通過(guò)無(wú)性方式進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，而這一過(guò)程往往是通過(guò)載體和寄主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 目前，以大腸桿菌為寄主，以質(zhì)粒和噬菌體等為載體的基因克隆體系已經(jīng)相當(dāng)?shù)某墒臁? 酶切 由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。目的基因也被切成碎片！ BamH I BamH I BamH I gene 二、隨機(jī)片斷化 1. 限制性內(nèi)切酶局部消化法 控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開(kāi)。 （ 1）限制性內(nèi)切酶的選用原則 1） 4bp的內(nèi)切酶 平均每 46（ 4096） bp一個(gè)切點(diǎn)。 隨機(jī)程度高。 ② 內(nèi)切酶粘性末端 能與常用克隆
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