mrna及sshppt課件-展示頁(yè)
2025-05-12 18:39本頁(yè)面
【正文】 (Suppression subtractive Hybridization)第一節(jié)mRNA差異顯示技術(shù)及其應(yīng)用一、 mRNA差別顯示技術(shù)概述n mRNA差異顯示技術(shù) (mRNA差異顯示 PCR、差別顯示反轉(zhuǎn)錄 PCR) （ mRNA differential display reverse transcripion PCR， DDRT—PCR）n 1992年，美國(guó)波斯頓 Dena Farber癌癥研究所n 、 （ 乳腺癌細(xì)胞與正常乳腺細(xì)胞）n 從一對(duì)細(xì)胞群體或一對(duì)基因型各自產(chǎn)生的約 15000種 mRNA中，有效地鑒定并分離出差別表達(dá)的基因。n 水稻的抗鹽基因、草莓的成熟基因、水稻蔗糖調(diào)節(jié)基因、擬南芥臭氧誘導(dǎo)基因。n 比較同一類(lèi)細(xì)胞在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的基因表達(dá)的差異，是克隆特異表達(dá)基因的方法。n 所謂的 “錨定 ”就是指一端已經(jīng)定死了，另一端通過(guò)人工合成引物來(lái)定，這就為許多我們對(duì)不清楚其 5’端區(qū)域或是 3’端區(qū)域的 RNA的分析找到了一條良好的途徑。端錨定引物： n 5‘ T12MN 3 ’ （ M為除了 T以外的任何一種核苷酸（即 A\G\C)、 N為任何一種核苷酸）n 539?？梢詫⒄麄€(gè) mRNA群體在 cDNA水平分成大致相等的但序列結(jié)構(gòu)不同的 12份亞群體。 AA 3’3 39。 AGAAA CGAAA GGAAA UGAAA AUAAA CUAAA GUAAA UUAAA ACAAA CCAAA GCAAA UCAAA TC TTT GC TTT CC TTT AC TTT TA TTT GA TTT CA TTT TT 5’ 3’ TT – 5’3’ TT 5’ 3’ TT 5’3’ TT 5’二、 DDRT技術(shù)的原理 （二 ） 基本原理n 5 39。 端隨機(jī)引物的長(zhǎng)度是 10個(gè)核苷酸，可以同特定細(xì)胞類(lèi)型的總 mRNA群體中的一部分分子發(fā)生雜交作用，雜交的部位是隨機(jī)地分布在距每條新合成的 cDNA鏈 3 39。n 引物對(duì)， 50100條 100500bp之間的 DNA條帶n 12種 3 39。 端隨機(jī)引物 240組引物對(duì)就能產(chǎn)生出 20 000條 DNA條帶。 提取 B組織 RNA提取 A組織 RNA錨定引物（ GT15A,GT15G,GT15C）反轉(zhuǎn)錄錨定引物（ GT15A,GT15G,GT15C）反轉(zhuǎn)錄總 RNA完整性鑒定 總 RNA完整性鑒定獲得 cDNA第一鏈 獲得 cDNA第一鏈隨機(jī)引物擴(kuò)增獲得 cDNA第二鏈 隨機(jī)引物擴(kuò)增獲得 cDNA第二鏈采用隨即引物和錨定引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增采用隨即引物和錨定引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析處理 對(duì)照將差異條帶切出并進(jìn)行回收重新用相同的錨定引物和隨即引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增Northern雜交， Southern雜交確定差異條帶的真實(shí)性克隆進(jìn)入質(zhì)粒載體測(cè)序、進(jìn)入 GeneBank序列分析三、 mRNA差別顯示技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)n 優(yōu)點(diǎn)n ① 幾乎可檢測(cè)到細(xì)胞表達(dá)的所有基因n ② 可以同時(shí)比較多個(gè)樣品間基因表達(dá)的差異 ③ 具有簡(jiǎn)便、靈敏、 RNA用量少、效率高經(jīng)過(guò) PCR擴(kuò)增一些低豐度的 mRNA也可以被檢測(cè)出來(lái) ④ 可同時(shí)比較多種給定生理狀態(tài)或不同發(fā)育階段的細(xì)胞內(nèi) mRNA三、 mRNA差別顯示技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)n 缺點(diǎn) 1）所得特異性 cDNA片段假陽(yáng)性的比例高， 75% 原因：總 RNA有 DNA污染
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