植物原生質體的分離實驗-展示頁
2025-04-26 04:15本頁面
【正文】 驗結果結果討論六．課堂小結：根據(jù)學生的實驗結果進行總結。10．扣上蓋子，在26℃下進行暗培養(yǎng)。吸除上面的溶液。少許原生質體于載片上，蓋片觀察其形態(tài)，檢測純度。6．用1mL注射器向離心管底部緩緩注入20%的蔗糖溶液1ml，出現(xiàn)下部蔗糖液， min，在兩液相之間出現(xiàn)一條綠色帶，便是純凈的原生質體。吸除上面的酶液。用血球計數(shù)板計數(shù)。（酶液：4%纖維素酶， 2%果膠覆酶，）。圓片扣壓于 。實驗方法1．把葉片(或花期短的花瓣)洗凈，把表面水吸干。因此，取材成為實驗成功與否的首要問題。但在實際操作中，只有幼嫩的組織才能完成去壁的過程。 細胞計數(shù)一般用血細胞計數(shù)極，按白細胞計數(shù)法進行計數(shù)。 一旦進入原生質體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生 具有熒光的極性物質熒光素。測定原生質體的活性有多種方法。 其次,還應當考慮取材、酶的種類和純度、酶液 的滲透壓、酶解時間及溫度等因素對分離原生質 體的影響。其中,酶解法分離原生質體是一個常用的技術,其原理是植物細胞壁主要由纖維 素、半纖維素和果膠質組成,因而使用纖維素 酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分,除 去細胞壁,即可得到原生質體。四．授課方式與教學方法：講解原理、實驗操作示范或具體指導。掌握細胞計數(shù)的原理和方法。二．重點：掌握分離和培養(yǎng)原生質體的技術、方法和原理。掌握細胞活性的檢測方法。n 當前文檔修改密碼：8362839實驗一 植物原生質體的分離和培養(yǎng)一．教學目標：了解植物原生質體作為細胞工程研究的重要意義，了解原生質體活性鑒定的原理。掌握分離和培養(yǎng)原生質體的技術、方法和原理。掌握細胞計數(shù)的原理和方法。掌握細胞活性的檢測方法。三．難點：分離和培養(yǎng)原生質體的技術。五．教學內容:實驗原理植物原生質體(protoplast)是除去細胞壁后 為原生質所包圍的“裸露細胞”,是開展基礎研 究的理想材料。由于原生質體內 部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細胞膜,必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生質體分離后不致膨脹破裂，滲透劑常用甘露醇或蔗糖，酶液還應含一定Ca2+來穩(wěn)定原生質膜。將原生質體接種在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，細胞壁再生，細胞分裂和再生植株。熒光素雙醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法,FAD 本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質膜。它不能自由出入原 生質膜,因此有活力的細胞能產(chǎn)生熒光,無活力 的原生質體不能分解FAD無熒光產(chǎn)生。從理論上講，植物體的任何一部分都可以通過酶解作用去除細胞壁而得到原生質體。所以，為了制備健康的原生質體，一般選用根尖、莖尖、嫩葉及對數(shù)生長期的愈傷組織為材料，一旦細胞具有木質化或次生加厚的外壁，則不能被酶降解。 花期短的花瓣，由于其組織鮮嫩，又具有色素標記，是該實驗中較好的材料。（2人一組）2．撕去葉片背面的表皮，用2ml離心管的蓋打下1圓片。讓去除下表皮的一面接觸酶液，輔滿一層。3．28~30℃保溫酶解2~6h（放培養(yǎng)箱中）；鏡檢葉肉細胞原生質體。4．600 rpm 離心5min，使原生質體沉降。5． mol/L ，輕輕吹打均勻。7．用1mL注射器取出管底的雜質、下部蔗糖溶液和上部氯化鈣液。8．加MS培養(yǎng)液液1ml洗滌，輕輕混勻，600 rpm 離心5min，使原生質體沉降。9．, 輕輕混勻, 用血球計數(shù)板計數(shù)細胞密度, FDA染色測定原生質體的活性。觀察細胞壁的再生和細胞分裂。 細胞計數(shù)板的使用：細胞計數(shù)板系一長方形厚玻片，常用的
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