三、基因工程的基本條件-工具酶和細(xì)胞-展示頁(yè)
2025-01-30 22:06本頁(yè)面
【正文】 同表達(dá) 1968年， Smith等人首先從 流感嗜血桿菌 d株中分離出 Hind II和 Hind III 限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的 外源 DNA切成小片斷。 （ 1）限制（ Restriction） 細(xì)菌自身的 DNA堿基被 甲基化酶 甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。 （ 1）識(shí)別位點(diǎn)序列 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK： AAC(N)6GTGC I型限制性內(nèi)切酶 如 EcoB和 EcoK。 需 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷甲硫氨酸）。 Recognize site cut （ 2）切割位點(diǎn) 首先由 . Smith和 . Wilcox在 1970年從流感嗜血菌中分離出來(lái)。 在基因工程操作中用途不大。 ii）同一個(gè) DNA分子內(nèi)連接： 通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成 環(huán)形分子 。 ③ 補(bǔ)平成平齊末端 凸出的 3’端 可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如 AAA或 TTT等）造成人工粘性末端。 粘性末端可以用 DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。 同裂酶（ Isoschizomers) ① 完全同裂酶： 識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。 Hind Ⅲ 5’A?AGCTT3’ 3’TTCGA?A5’ Hsu I 5’A?AGCTT3’ 3’TTCGA?A5’ Xma I 5’C?CCGGG 3’ 3’GGGCC?C5’ Sma I 5’CCC?GGG3’ 3’GGG?CCC5’ 識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。 ② 不完全同裂酶： 識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 5’?GATC3’ 3’CTAG?5’ Sau 3A 同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能 再被原來(lái)的酶識(shí)別。 容積活性： 1ul酶溶液中具有的酶活性單位。 限制性核酸內(nèi)切酶 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)： 高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端 pH值 等， 會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即 所謂的 Star activity現(xiàn)象 EcoR I在正常條件下識(shí)別并切割 5‘ GAATTC3’序列，但在甘 油濃度超過(guò) 50%（ v/v） 時(shí)，也可切割 5‘ PuPuATPyPy3’或者 5‘ AATT3’ 五種緩沖液： A B H M L，每種酶只有在最適的反應(yīng)緩沖液中才具有最強(qiáng)的催化活性。 大多數(shù)是 37 oC，少數(shù)要求 4065 oC。 （ 2） DNA3’端有游離的 OH， 5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（ P）。 連接反應(yīng)的機(jī)理 2. ATP與連接酶形成共價(jià) “ 連接酶 AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸 PPi。 OCCCH2CH2CH2CH2NH2+ +H3N AMP ATP PPi 4. AMP隨后從連接酶的賴氨酸 ?氨基轉(zhuǎn)移到 DNA一條鏈的 5‘端 P上，形成 “ DNA腺苷酸 ” 復(fù)合物。 DNA連接酶 DNA連接酶的基本性質(zhì) 連接多個(gè)平頭雙鏈 DNA分子： 5‘ … GCTCAGCTGGAG … 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTC … 5’ 5‘ … GCTCAGOH PCTGGAG … 3’ 3‘ … CGAGTCP OHGACCTC … 5’ T4DNA連接酶 DNA連接酶 平頭雙鏈 DNA片段的連接操作 從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多 提高平頭末端連接效率的方法包括： 加大連接酶用量（ 10倍大于粘性末端的連接） 加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì) 加入 10% PEG8000， 促進(jìn)大分子之間的有效作用 加入單價(jià)陽(yáng)離子（ NaCl）， 最終濃度 150200 mM DNA連接酶 DNA連接酶的反應(yīng)條件 TrisHCl 50 100 mM pH MgCl2 10 mM ATP 1 mM DTT 5 mM Volume 10 20 ml T T 4 15 ℃ 4 16 hr 1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下 15 ℃ 反應(yīng) 1 小時(shí)， 完全連接 1 mg lDNA（ Hind III片段）所需的酶量 增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。 五 影響連接反應(yīng)的因素 10~20倍。 2. 主要區(qū)別 T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè) dNTPs而不從模板上掉下來(lái)。 DNA聚合酶 3’?5’外切酶活性 5’?3’外切酶活性 聚合速率 持續(xù)能力 大腸桿菌 DNA聚合酶 低 有 中 低 Klenow fragment 低 無(wú) 中 低 T4DNA聚合酶 高 無(wú) 中 低 T7DNA聚合酶 高 無(wú) 快 高 化學(xué)修飾 T7DNA聚合酶 無(wú) 無(wú) 快 高 逆轉(zhuǎn)錄酶 無(wú) 無(wú) 低 中 Taq DNA聚合酶 無(wú) 有 快 高 常用 DNA聚合酶的特性比較 DNA聚合酶 大腸桿菌 DNA聚合酶 I（ DNA pol I ） 5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性 5‘ →3 ‘ 的核酸外切酶活性 3‘ →5 ‘ 的核酸外切酶活性 大腸桿菌 DNA聚合酶 I的基本性質(zhì)： 3‘ … GCTCAGCTGGAGA… 5’ 5‘ … CGAGTOH 5‘ ppp dNTP Mg2+ 3‘ … GCTCAGCTGGAGA… 5’ 5‘ … CGAGTCGACCOH DNA pol I DNA聚合酶 大腸桿菌 DNA聚合酶 I（ DNA pol I ） 切口前移標(biāo)記法 大腸桿菌 DNA聚合酶 I 的基本用途： 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a32PdATP） 5‘ … GCTC AGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ 5‘ … GCT
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