【正文】 機制及干預措施研究最為前沿和關鍵的科學問題。團隊成員包括分子生物學、細胞生物學和耳鼻喉科臨床專家，在感音神經(jīng)性聾研究領域基礎扎實，已經(jīng)在Nature Med、 N Eng J Med、 PNAS等國際著名雜志發(fā)表感音神經(jīng)性聾的相關研究結果。致聾機制研究和有效的干預措施研究并重，通過機制研究的結果為干預措施提供依據(jù)； 3. 在研究策略上，采用基礎研究結合臨床研究的策略，重點研究關鍵的科學核心問題，為建立我國常見感音神經(jīng)性聾的早期診斷、有效的預防及生物學干預措施提供理論依據(jù)； 4. 在臨床資源上 ，課題組單位有 3 個國家耳鼻喉科重點學科、一個衛(wèi)生部聽覺醫(yī)學重點實驗室及一個衛(wèi)生部新生兒聽力篩查中心（已建立全國新生兒聽力篩查網(wǎng)絡），我們已經(jīng)擁有了龐大的感音神經(jīng)性聾家系的 DNA 樣本庫。結合毛細胞離子通道特征、毛細胞換能及適應性和非特異性離子通道的實驗結果鑒定再生毛細胞功能。 2）同時轉染激活前體細胞增殖和促毛細胞分化基因激活毛細胞再生：采用已構建的 腺病毒載體，觀察過量表達 Pax2 及 Math1 基因?qū)Τ赡晔蠖佒С旨毎鲋澈头只挠绊懀噲D過量表達 Pax2 激活支持細 胞增殖，同時在增殖細胞中表達 Math1 誘導增殖細胞向毛細胞分化，從而誘導成年鼠耳蝸毛細胞再生。 （ 2） 采用膜片鉗結合免疫組化技術對具有神經(jīng)元標志物的移植細胞在熒光顯微鏡下行單細胞的電生理研究，檢測移植細胞分化的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電生理特征。以膜片鉗技術檢測 EGFP 陽性的干細胞源毛細胞電生理特征，并用毛細胞標志物標記確認毛細胞，結合毛細胞離子通道特征、毛細胞換能和適應性及非特異性離子通道鑒定干細胞源毛細胞的功能。 5. 聲刺激誘導耳蝸植入干細胞分化機制的研究 1）基因修飾胚胎干細胞及誘導性多潛能干細胞分化為毛細胞的實驗研究 （ 1） 將構建的 pax2IRESmath1EGFP 基因修飾的干細胞經(jīng)鼓階移植到毛細胞損傷的動物模型 耳蝸，利用聲刺激誘導移植細胞定向分化后，用免疫組化及電鏡技術鑒定細胞分化情況。 （ 3） 以線粒體基因組為核心，研究核基因和線粒體基因相互作用的機制及發(fā)現(xiàn)新的基因突變；研究調(diào)控蛋白質(zhì)輸入及抗氧化劑對線粒體缺失大鼠模型耳蝸損傷的保護機制；研究 mtDNA4834bp 缺失模型中相關氧化磷酸化在耳蝸毛細胞損傷中的作用及其機制； （ 4） 建立 CD 缺失的邊緣細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞系，研究老年性聾相關基因及抗衰老基因與 CD 的相互作用及機制。 4. 老年性聾發(fā)病機制及預防措施的研究 1）老年性聾模 型耳蝸毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷機制研究： （ 1） 我們已經(jīng)建立了大鼠 CD 老年性聾大鼠模型，研究大鼠 CD 模型對環(huán)境因素易感性，針對易感基因測序，發(fā)現(xiàn)新的核基因和線粒體基因突變。 （ 3） RNA 干擾對毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷的保護作用。 2） 毛細胞保護措施實驗研究： （ 1） MPTP 亞單位配體對線粒體 MPTP 開啟的調(diào)控及 Bif1 表達對毛細胞的保護作用。 3. 耳蝸毛細胞損傷及保護機制的研究 1）耳蝸損傷機制研究：以毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元線粒體為核心，觀察不同環(huán)境因素作用下毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元死亡形式及相關信號途徑的活化，研究耳蝸毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡途徑。 （ 2） 干預 EVA 的實驗研究。 3）轉基因技術糾正遺傳缺陷所致耳聾的實驗研究： （ 1） 干預 Connexin 基因突變導致耳聾的實驗研究。針對研究中發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳學變化的基因，將它們分別和組合地在耳蝸干細胞中下調(diào)或上調(diào)，觀察相應靶基因和信號通路的變化，以及耳蝸干細胞的分化情況。 3）研究遺傳性聾規(guī)范化產(chǎn)前診斷技術：以母體外周血胎兒細胞分離與胎兒 DNA富集為研究重點，開發(fā)非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷技術；結合產(chǎn)前診斷需求和 高通量基因篩查技術平臺，研究并初步建立規(guī)范性聾病產(chǎn)前診斷體系，對其模式、效果進行評估。 1. 遺傳性聾相關新基因識別及其功能的研究 1） 耳聾相關新基因發(fā)現(xiàn)及功能鑒定：用我們課題組收集的遺傳性耳聾家系資源，運用大家系連鎖定位分析，全基因組關聯(lián)分 析，基因功能性克隆等策略在耳聾患者樣本中發(fā)現(xiàn)新的耳聾基因及新突變位點；在斑馬魚和小鼠的干細胞階段上調(diào)或下調(diào)新發(fā)現(xiàn)耳聾基因，觀察兩種模式動物耳蝸和聽力發(fā)育情況，研究新發(fā)現(xiàn)耳聾基因的功能。通過本項目的系統(tǒng)研究，以期闡明我國常見感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制及病理生理過程，為建立遺傳性聾產(chǎn)前診斷和老年性聾分子診斷技術奠定基礎，探索耳蝸毛細胞保護和聽覺功能重建生物學技術，為提高我國感音神經(jīng)性聾的防治水平提供理論依據(jù)。遺傳、 老化因素所致毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的早期診斷：在致聾機制研究的基礎上，研究遺傳性耳聾產(chǎn)前分子診斷及老年性聾分子診斷技術與理論，為建立感音神經(jīng)性聾的防控體系提供依據(jù)。 三、研究方案 1）學術思路： 本項目圍 繞“毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷機制、保護措施及功能重建”這個感音神經(jīng)性聾防治的關鍵科學問題，探索感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制及有效的干預措施，研究重點是揭示重度感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制、病理生理過程及生物學干預策略。 5. 在國際重要雜志發(fā)表 IF 的論文 20 篇以上， IF≥10 的論文 5 篇以上，IF≥20的論文 1 篇以上。 五年預期目標 : 1. 闡明遺傳、環(huán)境和老化等因素導致感音神經(jīng)性聾的機制及各種有害因素在致聾機制中的相互作用； 2. 為建立規(guī)范化的遺傳性聾產(chǎn)前診斷和老年性聾早期分子診斷技術及預防體系提供實驗依據(jù)； 3. 建立耳蝸毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的保護措施及 干預感音神經(jīng)性聾的生物學技術和理論； 4. 培養(yǎng)一批我國具有國際競爭力的優(yōu)秀聽覺醫(yī)學研究人才，以六個課題單位為基地，預計培養(yǎng)國家杰出青年科學基金獲得者、教育部“長江學者特聘教授”和中科院“百人計劃”入選人才共 35 名；教育部“新世紀人才計劃” 68 名。 項目名稱： 感音神經(jīng)性聾發(fā)病機制及干預措施的基礎研究 首席科學家： 李華偉 復旦大學 起止年限： 至 依托部門： 教育部 上海市科委 項目名稱： 近視發(fā)病機理及干預的基礎研究 首席科學家： 瞿佳 溫州醫(yī)學院 起止年限： 至 依托部門： 浙江省科技廳 二、預期目標 本項目的總體目標： 本項目以人類最常見的感官或功能缺陷性疾病感音神經(jīng)性聾為研究對象，圍繞“毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷機制、保護措施及聽覺功能重建”這個感音神經(jīng)性聾防治的關鍵科學問題，闡明遺傳、環(huán)境及老化等因素所致感音神經(jīng)性聾的機制，探索新的感音神經(jīng)性聾干預措施，降低常見感音神經(jīng)性聾的發(fā)病率，為提高我國常見感音神經(jīng)性聾的早期診斷和治療水平提供實驗依據(jù)。總體提高我國在感音神經(jīng)性聾的基礎研究和臨床防治研究的國際競爭力。培養(yǎng)一批優(yōu)秀的博士后、博士研究生和碩士研究生。 6. 爭取獲得 12 項國家級科技進步獎。毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷機制：研究遺傳、環(huán)境（感染、噪聲、耳毒性藥物）及老化等因素所致毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷的致聾機制，發(fā)現(xiàn)遺傳性聾相關的新致聾基因，研究我國常見致聾基因的功能及耳蝸損傷機制；研究遺傳因素與環(huán)境因素在耳蝸毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷中的相互作用，探索老年性聾的發(fā)病機制。毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷保護及功能重建：建立安全有效的耳蝸基因轉染技術，探索保護耳蝸毛細胞免于損傷的抗凋亡等理論與技術；探索轉基因策略修復基因缺陷所致耳蝸毛細胞損傷的機制；采用聲刺激誘導植入耳蝸的經(jīng)過基因修飾的干細胞定向分化，研究植入干細胞定向分化為毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的分子機制，探索細胞替代策略重建聽覺功能的有效途徑；通過調(diào)控細胞周期 因子激活耳蝸毛細胞再生，鑒定再生毛細胞的功能，為細胞再生途徑重建聽覺功能提供理論依據(jù)。 2）技術途徑： 參考下列技術路線示意圖。 2） 遺傳性耳聾基因型和聽力表型的相關研究：聯(lián)合耳聾基因篩查與聽力篩查，通過對多種聾病表型（如耳聾發(fā)病時間、聽力損失程度、受環(huán)境因素影響等）的歸類研究建立不同遺傳性耳聾的基因型 表型關聯(lián)聯(lián)系。 2. 我國常見耳聾相關基因致聾機制的研究 1）遺傳性聾相關基因表觀遺傳學研究：采用芯片技術系統(tǒng)觀察遺傳感音性聾耳聾相關基因 DNA 甲基化、微小 RNA、組蛋白乙?；图谆兓诟嗟臉颖局羞\用 MassArray 技術高通量驗證這些變化發(fā)生的比率。 2）常見耳聾相關基因致聾機制：應用 RNAi 技術、鋅指核酶技術、精原細胞注射技術和轉基因技術，研究我國常見耳聾相關基因（ Connexin 基因、 EVA 相關基因 SLC26A4 和 Foxi1 等）突變所致耳蝸內(nèi)環(huán)境平衡紊亂的機制及毛細胞功能障礙。轉染野生型 Connexin26 或30 基因修復 Cx26 及 Cx30 突變鼠耳蝸損傷。以 EVA 耳聾動物模型 SLC26A4/基因敲除小鼠為對象，針對 SLC26A FOXI KCNJ10 三個靶基因進行基因糾正的實驗研究。 （ 1） 線粒體 MPTP 狀態(tài)與耳蝸損傷的關系：檢測線粒體膜電位及環(huán)境因素作用下線粒體 MPTP 亞單位基因的表達； （ 2） 毛細胞損傷過程中氧化應激反應與耳蝸損傷的關系：檢測環(huán)境因素作用下內(nèi)耳自由基及氧化應激相關基因的表達 ； （ 3） 內(nèi)耳 miRNA 的表達及其對線粒體相關基因、凋亡基因及毛細胞功能的影響。 （ 2） 調(diào)控氧化應激反應與毛細胞損傷保護，以及抗凋亡基因 XIAP 耳蝸局部轉染對耳蝸毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的保護作用。 （ 4） 研究安全、有效、便于臨床應用的耳蝸局部給藥途徑。 （ 2） 研究各模型（ CD 大鼠， C57BL/6 小鼠和 DBA/2J 小鼠）內(nèi)耳酶功能及神經(jīng)生理學改變。 2）研究老年性聾早期分子診斷技術：根據(jù)研究內(nèi)容 1）的研究結果，篩選老年性聾的易感基因，經(jīng)過臨床收集的老年性聾資料驗證，探索老年性聾的早期分子診斷技術及理論依據(jù)。 （ 2） 采用膜片鉗技術結合 FM143 熒光染色技術鑒定干細胞源毛細胞的功能。 2）定向誘導干細胞分化為螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元 （ 1） 將螺旋神經(jīng)元損傷的動物模型在干細胞移植后分為兩組，分別接受 60 dB和 90 dB SPL 白噪聲刺激，應用聽力學技術檢測實驗動 物聽力恢復情況；采用熒光金標記技術觀察分化神經(jīng)元軸漿轉運及纖維投射，用免疫組化和分子生物學技術檢測移植后信號分子及神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達情況，觀察移植細胞遷移及移植后細胞向神經(jīng)元分化的比例和表達神經(jīng)遞質(zhì)的情況，評估不同強度聲刺激對移植細胞分化、遷移的影響及其分子機制。 6. 激活耳蝸毛細胞再生的研究 1）調(diào)控細胞周期因子激活耳蝸毛細胞再生：構建 病毒載體，研究轉基因技術過量表達 raf1 基因在體外毛細胞損傷模型上誘導耳蝸感覺上皮細胞再生情況；研究耳蝸再生細胞分化為毛細胞和支持細胞的能力以及過量表達raf1 基因后耳蝸殘存細胞 Rb 基因表達，并檢測 pRb 蛋白表達及其磷酸化情況，研究毛細胞再生的機制。 3）再生毛細胞功能鑒定：采用膜片鉗技術結合