【正文】 為 : m3106ml80000μ/ml247。 40250t 。 4 工藝計(jì)算 表 1 工藝計(jì)算基礎(chǔ)數(shù)據(jù) 年產(chǎn)量 10000t 發(fā)酵單位 80000μ /ml 發(fā) 酵周期 180h 成品效率 1000μ /mg 年工作日 320 天 發(fā)酵罐裝料系數(shù) 輔助時(shí)間 12h 種子罐裝料系數(shù) 消后大罐接種量 15% 種子罐發(fā)酵周期 60h 消后中罐接種量 8% 發(fā)酵期間補(bǔ)葡萄糖量 (m3?h) 物料衡算 發(fā)酵周期 180h,輔助時(shí)間 12h,則產(chǎn)一批青霉素需要 8 天。當(dāng)菌絲中空泡擴(kuò)大、增多及延伸 ,并出現(xiàn)個(gè)別自溶細(xì)胞 ,這表示菌絲趨向衰老 ,青霉素分泌逐漸停止 ,菌絲形態(tài)上即將進(jìn)入自溶期 ,在此時(shí)期由于茵絲自溶 ,游離氨釋放 ,pH 值上升 ,導(dǎo)致青霉素產(chǎn)量下降 ,使色素、溶解和膠狀雜質(zhì)增多 ,并使發(fā)酵液變稠 ,增加下一步提純時(shí)過濾的困難。 6 泡沫的控制 在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫 ,可以用天然油脂 ,如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑 泡敵 來消泡 ,應(yīng)當(dāng)控制其用量并要少量多次加入 ,尤其在發(fā)酵前期不宜多用 ,否則會(huì)影響菌體的呼吸代謝 7 發(fā)酵液質(zhì)量控制 生產(chǎn)上按規(guī)定時(shí)間從發(fā)酵罐中取樣 ,用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵 ,生產(chǎn)上慣稱 鏡檢 。 5 溶解氧的控 制 一般要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的 30%。 C,后期 23176。目前一般采用加酸或加堿控制 pH 值 4 溫度控制 前期 25176。 2 補(bǔ)氮及加前體 補(bǔ)氮是指加硫酸銨、氨水或尿素 ,使發(fā)酵液氨氮控制在%%,補(bǔ)前體以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為 %%。 加入的無機(jī)鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等 ,且用量要適度。 生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素 G,需在發(fā)酵液中加人前體。目前生產(chǎn)上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 DE 值 50%以上進(jìn)行流加。球狀菌以新鮮孢子為佳 ,其生產(chǎn)水平優(yōu)于真空干燥的孢子 ,能使青霉素發(fā)酵單位的罐批差異減少。 工藝要求將新鮮的生產(chǎn)米指收獲后的孢瓶在 10 天以內(nèi)使用接人含有花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內(nèi) ,28176。親米、生產(chǎn)米子孢子都需保存在 5176。 C靜置培養(yǎng) ,需經(jīng)常觀察生長發(fā)育情況在培養(yǎng)到 34天 ,大米表面長出明顯小集落時(shí)要振搖均勻 ,使菌絲在大米表面能均勻生長 ,待 10 天左右形成綠色孢子即可收獲。 C 培養(yǎng) 24h,菌絲體積 10%12%,形態(tài)正常 ,效價(jià)在 700D/ml 左右便可作為發(fā)酵種子。生產(chǎn)時(shí)它按一定的接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主的種子罐內(nèi) ,26 176。 工藝控制要點(diǎn) 種子質(zhì)量的控制 絲狀菌的生產(chǎn)種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管經(jīng)甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固體上 ,25176。而在球狀菌發(fā)酵中 ,使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊 ,并盡量減少游離菌絲的含量 ,也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低 ,使氣 液兩相間氧的傳遞速率大大提高 ,從而允許更多的菌絲生長 即臨界菌體濃度較高 ,發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。 菌絲形態(tài) 在長期的菌株改良中 ,青霉素產(chǎn)生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要呈絲狀生長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。事實(shí)上 ,青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長速率要比這一理論臨界值低得多 ,卻仍然能達(dá)到很高的比生產(chǎn)速率。這一比生長速率稱為臨界比生長速率。 菌絲生長速度 用恒化器進(jìn)行的發(fā)酵試驗(yàn)證明 ,在葡萄糖限制生長的條件下 ,青霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長速率之間呈現(xiàn)一定的關(guān)系。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強(qiáng)度取決于維持因數(shù)的大小 ,維持因數(shù)越大 ,呼吸強(qiáng)度越高、發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學(xué)性質(zhì)而異。少量多次 ,不適在前期多加入 ,影響呼吸代謝。溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡點(diǎn) ,而氧消耗與碳能源消耗成正比 ,故溶氧 濃度也可作為葡萄糖流加控制的一個(gè)參考指標(biāo)。當(dāng)溶氧濃度降 30%飽和度以下時(shí) ,青霉素產(chǎn)率急劇下降 ,低于 10%飽和度時(shí) ,則造成不可逆的損害。過低的加糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起 pH 值上升。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中 ,pH 值的變化是葡萄糖流加速度 高低的反映。對(duì)菌絲生長和青霉素合成來說 ,最適溫度不是一樣的 ,一般前者略高于后者 ,故有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用較高的溫度 ,以縮短生長時(shí)間 ,到達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度 ,以利于青霉素的合成。 C 左右。目前 ,糖濃度的檢測尚難在線進(jìn)行 ,故葡萄糖的流加不是依據(jù)糖濃度控制 ,而是間接根據(jù) pH 值、溶氧或 C02 釋放率予以調(diào)節(jié)。 3 工藝控制及要點(diǎn) 工藝控制 影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素 基質(zhì)濃度在分批發(fā)酵中 ,常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過高 ,對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏 (或抑制 )或?qū)z生長產(chǎn)生抑制 (如葡萄糖和錢的阻遏或抑制 ,苯乙酸的生 長抑制 ),而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長和產(chǎn)物合成 ,為了避免這一現(xiàn)象 ,在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法 ,即對(duì)容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用的基質(zhì)進(jìn)行緩慢流加以維持一定的最適濃度。在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。 1~4 期為菌絲生長期 ,3 期的菌體適宜為種子。 第六期 :出現(xiàn)個(gè)別自溶細(xì)胞 ,細(xì)胞內(nèi)無顆粒 ,仍然桶狀 ,釋放游離氨 ,PH上升。 第四期 :脂肪包涵體形成小滴并減少 ,中小空泡 ,原生質(zhì)體嗜堿性減弱 ,開始產(chǎn)生抗生素。 第二期 :菌絲繁殖 ,原生質(zhì)體具有嗜堿性 ,類脂肪小顆粒。在規(guī)定時(shí)間取樣 ,通過顯微鏡檢查 (生產(chǎn)上習(xí)慣稱為鏡檢 )這些形態(tài)變 化 ,用于過程控制。 D:二級(jí)種子發(fā)酵罐 :玉米漿、蛋白質(zhì)等。 B:米孢子培養(yǎng)基 :優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基。過高則導(dǎo)致呼吸活性下降 ,甚至 引起自溶 ,葡萄糖濃度調(diào)節(jié)是根據(jù) PH、溶氧量或 CO2 釋放率予以調(diào)節(jié)。發(fā)酵過程中采用補(bǔ)料分批操作法 ,對(duì)葡萄糖、銨、苯乙酸進(jìn)行緩慢流加 ,維持一定的最適濃度。但濃度大于 %時(shí)對(duì)細(xì)胞和合成有毒性 ,還能被細(xì)胞氧化。 添加前體 不加側(cè)鏈前體時(shí) ,青霉素生產(chǎn)多種青霉素混合物。 流加控制 根據(jù)殘液 PH、尾氣中 CO2 和 O2 的含量 ,殘?zhí)窃?%左右 ,PH 開始升高時(shí)加糖。 無機(jī)鹽 包括硫、磷、鎂、鉀等。 氮源的選擇 玉米漿是玉米淀粉生產(chǎn)時(shí)的副產(chǎn)品 ,是最好的氮源 ,含有各種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。當(dāng)葡萄糖耗盡后 ,利用緩效的乳糖 ,使 PH 穩(wěn)定 ,分泌青霉素。葡萄糖、乳糖結(jié)合能力強(qiáng) ,而且隨時(shí)間延長而增加。從經(jīng)濟(jì)核算角度 ,生產(chǎn)成本中碳源占 12%以上 ,對(duì)工藝影響很大。 C,發(fā)酵 ,7 天 ,1:)??發(fā)酵液。 C,孢子培養(yǎng) ,8~10 天 )??生產(chǎn)米 (28176。 B:球狀菌二級(jí)發(fā)酵工藝流程 冷凍管 (25176。C, 種 子 培 養(yǎng) ,24h,1:)?? 二 級(jí) 種 子 培 養(yǎng) 液 (27~26 176。 C,孢子培養(yǎng) ,7 天 )??大米孢子 (26176。 2 青霉素發(fā)酵工藝流程 青霉素 發(fā)酵工藝流程路線 它們的發(fā)酵工藝流程有所不同 : A:絲狀菌三級(jí)發(fā)酵工藝流程 冷凍管 (25176。青霉穗是分生孢子鏈狀的 ,深層培養(yǎng)菌絲分為球狀和絲狀兩種。 產(chǎn)青霉素的菌株分為球狀菌和絲狀菌。濾液在 pH2~ 的條件下 ,于萃取機(jī)內(nèi)用醋酸丁酯進(jìn)行多級(jí)逆流萃取 ,得到丁酯萃取液 ,轉(zhuǎn)入 ~ 的緩沖液中 ,然后再轉(zhuǎn)入丁酯中 ,將此丁酯萃取液經(jīng)活性炭脫色 ,加入成鹽劑 ,經(jīng)共沸蒸餾即可得青霉素 G 鉀鹽。在發(fā)酵過程中需補(bǔ)入苯乙酸前體及適量的培養(yǎng)基。用無菌水將孢子制成懸浮液接種到種子罐內(nèi)已滅菌的培養(yǎng)基中 ,通入無菌空 。 天然青霉素生產(chǎn)可分 為菌種發(fā)酵和提取精制兩個(gè)步驟。所以青霉素的藥用價(jià)值極大 ,研究設(shè)計(jì)其工藝和發(fā)酵車間設(shè)計(jì)對(duì)于每個(gè)青霉素工廠具有很好的經(jīng)濟(jì)效益。對(duì)革蘭陽性菌有效 ,由于革蘭陰性菌缺乏五肽 交連橋而青霉素對(duì)其作用不大。本品對(duì)流感嗜血桿菌和百日咳鮑特氏菌亦具一定抗菌活性 ,其他革蘭陰性需氧或兼性厭氧菌對(duì)本品敏感性差 .本品對(duì)梭狀芽孢桿菌屬、消化鏈球菌、厭氧菌以及產(chǎn)黑色素