重組dna技術(shù)1-文庫(kù)吧資料
2024-11-25 23:21本頁(yè)面
【正文】 國(guó)斯坦福大學(xué)教授 Cohn和美國(guó)加州大學(xué)教授Boyer帶領(lǐng)各自的研究組幾乎同時(shí)分別完成了 DNA體外重組 ，一舉打開(kāi)了基因工程學(xué)大門 。 pUC118質(zhì)粒的 多克隆位點(diǎn)整合在 lacZ基因中 ， 該位點(diǎn)如果沒(méi)有插入外源目的基因 ， lacZ基因便可表達(dá)出 ?半乳糖苷酶 ， 如果平板培養(yǎng)基中含有 IPTG（ 乳糖操縱子 的 誘 導(dǎo)物 ） 和 Xgal， Xgal（ ?半乳糖苷酶的底物 ） 便會(huì)被 ?半乳糖苷酶水解成蘭色 ， 大腸桿菌形成 藍(lán)色克隆 。 ? 通過(guò) DNA體外重組技術(shù)構(gòu)建的重組質(zhì)粒還可以直接用以轉(zhuǎn)化藍(lán)藻等原核生物或其他一些原生生物 。 ? 若需要讓克隆的基因表達(dá)和產(chǎn)生大量編碼蛋白 ， 可對(duì)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)使目的基因大量表達(dá)和積累 。 質(zhì)粒 質(zhì)粒載體 的一般結(jié)構(gòu) DNA克隆常用載體 ? 基因克隆獲得大量目的基因后 ， 就要使其在合適的宿主細(xì)胞 中表達(dá) ， 產(chǎn)生需要的基因表達(dá)產(chǎn)物或使宿主生物具備所需的性狀 ， 同時(shí)目的基因還能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳 。 ? 質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中自然存在于染色體外可以自主復(fù)制的一段環(huán)狀 DNA分子 。 構(gòu)建重組質(zhì)粒 DNA和基因克隆 ? 限制性內(nèi)切酶 ? 限制性內(nèi)切酶 是從細(xì)菌中分離提純的 核酸內(nèi)切酶 ，可以識(shí)別并切開(kāi)核酸序列特定位點(diǎn) —— 分子手術(shù)刀 ? Arber、 Smith和 Nathans因?yàn)樵诎l(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面開(kāi)創(chuàng)性工作而共同獲得了 1978年的諾貝爾獎(jiǎng) 。 ? 加入 4種物質(zhì) ： （ 1） 作為模板的 DNA序列； （ 2）與被分離的目的基因兩條鏈 各自 5’端序列相互補(bǔ)的DNA引物（ 20個(gè)左右堿基的短 DNA單鏈）； （ 3） TaqDNA聚合酶； （ 4） dNTP（ dATP, dTTP, dGTP和 dCTP）。 包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上 ， 轉(zhuǎn)染細(xì)菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫(kù) 。 （ 4） 化學(xué)合成 獲得需要的目的基因（外源基因） ? 細(xì)胞內(nèi)總 DNA的提取分離與基因組文庫(kù)的構(gòu)建 ? 細(xì)胞內(nèi)總 DNA的提取分離程序 苯酚沉淀蛋白質(zhì) ? 紫外分光光度計(jì)測(cè)定 DNA溶液的純度和濃度 。 ? 重組 DNA操作 一般步驟： （ 1）獲得目的基因； （ 2）與克隆載體連接，形成新的重組 DNA分子； （ 3）用重組 DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳； （ 4）對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定； （ 5）對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。 重組 DNA技術(shù)是基因工程的核心技術(shù) 基因工程 (geic engineering) ?所謂 基因工程 (geic engineering)就是 把外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi) ， 使這個(gè)基因能在受體
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