【正文】 等。技術路線： 建立HD動物模型 MSC的分離及體外培養(yǎng)MSC向神經干細胞的轉化 神經干細胞體外培養(yǎng)，克?。╒MYC，EGF等多種基因轉染，修飾）神經干細胞移植到HD動物無神經節(jié)細胞段誘導分化（維甲酸等） mRNA差異消減顯示技術顯示神經干細胞移植分化的分子機制 觀察無神經節(jié)細胞段腸神經系統(tǒng)形態(tài)及功能獲得通過MSC、神經干細胞移植對先天性巨結腸癥腸道神經組織重建的方法－51－—52—實驗方案：第一部分：建立HD動物大鼠參照文獻進行大鼠選育，源于WistarImamichi AR系，HD大鼠均結腸造瘺處理。擬解決的關鍵問題：１． MSC向神經干細胞的轉化；２． 神經干細胞的基因修飾； ３． 神經干細胞移植，定向分化的分子機制。2000，16（3）：196198(6) Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Ault rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res, 2000, 61(4): 364370—33—三、研究方案1. 研究目標、研究內容和擬解決的關鍵問題研究目標： 　　探索建立針對先天性巨結腸癥的MSC，神經干細胞移植治療方法。中樞神經干細胞。320例先天性巨結腸癥的診斷與治療分析。該課題的完成除能為兒童的健康成長做出巨大貢獻，并能帶動本地區(qū)整個小兒外科水平的發(fā)展，提高本地區(qū)小兒外科在國內及國際上的地位，為祖國西部大開發(fā)戰(zhàn)略的順利進行貢獻力量。由此激發(fā)了人們對ES細胞，骨髓干細胞，神經干細胞定向分化的研究。時代187?？傊?，隨著當今干細胞研究的深入，探索通過MSC轉化為神經干細胞恢復小兒外科常見疾?。ㄏ忍煨跃藿Y腸癥）正常神經支配的方法具有重要現實性及可能性。近期美國學者Woodbury等在體外實驗中成功地將源于成年大鼠及人骨髓MSC轉化為神經干細胞, 并進而分化為神經元[6]。前者的移植已成功用于臨床治療白血病，但其移植需要獲得足夠數量的造血干細胞，并且造血干細胞體外擴增存在困難。神經干細胞可以在體外大量增殖，但目前主要在海馬和室管膜下層發(fā)現有神經干細胞分布，這樣造成了神經干細胞來源困難。鑒于神經干細胞的多向分化潛能，在大腦，脊髓中的損傷修復研究中令人鼓舞的發(fā)現，自體造血干細胞等分化為神經干細胞可能性的提出[4] （此將為神經干細胞自體移植提供一個很好的來源），以及神經干細胞目前被認為是一種更優(yōu)于成纖維細胞的基因治療的載體細胞[5]，針對上面的問題我們提出如下假說：如同神經干細胞移植在恢復受損大腦，脊髓神經功能上具有良好的應用前景一樣，通過各種人工方法修飾后，神經干細胞移植有恢復HD 病變腸段的正常神經支配的可能。對于HD病變腸段不僅有神經節(jié)異常，尚有腸道平滑肌，結締組織的增生等變化的現象，我們注意到纖溶酶原激活因子（PA）能激活纖溶酶原，水解纖維蛋白，及細胞外基質中的纖連蛋白(fibronectin, Fn)，層粘連蛋白（laminin，Ln），基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase enzyme, MMP）能分解周圍組織—細胞外基質，如將PA，MMP的cDNA轉染修飾神經干細胞將有可能對HD病變段的病理變化進行改造，有利于神經干細胞生長，發(fā)育。神經干細胞在受到堿性成纖維細胞因子（FGF2）和上皮細胞生長因子（EGF）刺激時可分化出神經元和膠質細胞，EGF可維持神經干細胞的生成，FGF2對干細胞的分化起重要作用；有很多神經因子（如血小板生長因子，轉化生長因子等）對神經干細胞的分化起著協(xié)同作用。目前的問題是在臨床實踐中診斷的HD患兒均在出生后，此刻神經嵴細胞分化成熟，－31－且此—32—類患兒病變腸段不僅有神經節(jié)異常，尚有腸道平滑肌，結締組織的增生等細胞外基質變化，單純的神經嵴細胞移植一方面神經嵴細胞來源受限，另一方面能否在體內改造病變腸段的病理變化，仍需進一步研究。HD病因為胚胎早期神經嵴細胞移行受阻的結果，以往我們對HD的研究中也發(fā)現HD病變腸段不僅存在神經節(jié)細胞異常，神經膠質細胞也表現出異常，進一步支持了HD病因系胚胎早期神經嵴細胞移行異常的結果。神經干細胞是一種終身具有自我更新能力的細胞，其子細胞能分化產生神經系統(tǒng)的各類細胞，干細胞通過不對稱分裂產生一個祖細胞和另一個干細胞，祖細胞具有有限的自我更新能力，并自發(fā)分化產生成神經元細胞和成膠質細胞等，從而生成神經元及神經膠質細胞。傳統(tǒng)的發(fā)生生物學認為人體神經細胞一經受損就永遠不能再生新的神經元。在臨床及科研工作中我們注意到細胞療法（cell therapy）近年來已成為治療多種疾病的新策略，在替代，修復或加強受損的組織或器官的生物學功能方面有巨大作用。自發(fā)現HD的病因以來，HD的治療主要依靠手術切除遠端無神經節(jié)細胞段，手術方式較多，由于各種術式固有缺陷，目前仍存在各種并發(fā)癥，影響HD患兒術后恢復［１］。對HD 臨床及基礎研究一直是小兒外科研究的熱點之一。－2－ 二、立論依據（包括項目的研究意義、國內外研究現狀分析，并附主要參考文獻及出處） 對基礎研究，著重結合國際科學發(fā)展趨勢，論述項目的科學意義；對應用基礎研究，著重結合學科前沿、圍繞國民經濟和社會發(fā)展中的重要科技問題，論述其應用前景。本欄雙線右側內容不輸入計算機。參加單位數——指研究項目組主要成員所在單位數，包括主持單位和合作單位(合作者所在單位)，以阿拉伯數字表示。全稱中的數字，一律寫中文，例如：中國航天工業(yè)總公司第七○一所。所在單位名稱及代碼——按單位公章填寫全稱。終止時間為完成年度的 12月。申請金額——以萬元為單位，用阿拉伯數字表示，注意小數點。申報學科——申請項目所屬的最基礎學科?；A研究——指以認識自然現象、探索自然規(guī)律為目的，不直接考慮應用目標的研究活動。二、凡選擇性欄目，將相應提示符A、B等之一填入該欄的右下角。簡表中所有代碼以最新發(fā)布的《國家自然科學基金