【正文】 4. 重組蛋白的生產(chǎn) 第 六 章 基因工程總體策略 基因工程指用人為的方法將所需要的某一供體生物的 DNA提取出來(lái)，在適當(dāng)?shù)臈l件下用適當(dāng)?shù)拿盖懈詈?，把它與載體 DNA分子連接起來(lái)形成具有自我復(fù)制能力的 DNA分子 ——復(fù)制子，并將它轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)。 —致死率是最好的誘變劑相對(duì)劑量的表示方法。 制備： 物理誘變劑 —— 生理鹽水（ %NaCl) 化學(xué)誘變劑 —— 緩沖液 濃度： 細(xì)菌、放線菌 108個(gè) /ml 霉菌、酵母菌 106個(gè) /ml 第 六 章 表型遲延現(xiàn)象 :指某一突變?cè)?DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在表型上顯示出來(lái)，造成不純的菌落。 方法： ①玻璃珠打散 1015min。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株 ， 幾乎毫無(wú)例外地都是通過(guò)誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的 。 第 六 章 ?原生質(zhì)體融合的優(yōu)點(diǎn)： 可以提高重組率 雙親可以少帶標(biāo)記或不帶標(biāo)記 可進(jìn)行多親本融合 有利于不同種間、屬間微生物的雜交 通過(guò)原生質(zhì)體融合提高產(chǎn)量 第 六 章 原生質(zhì)體融合的主要步驟 ? 選擇親株 → →制備原生質(zhì)體 →→原生質(zhì)體融合 → →原生質(zhì)體 再生 → → 篩選優(yōu)良性狀的融合重組子 第 六 章 三、細(xì)菌遺傳變異的實(shí)際意義 ?誘變育種 ?在疾病的診斷、治療與預(yù)防中的應(yīng)用 ?在測(cè)定致癌物質(zhì)中的應(yīng)用 ?在流行病學(xué)中的應(yīng)用 ?在基因工程中的應(yīng)用 第 六 章 誘變育種 ： 是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì) （ DNA） 的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 ， 引起性狀變異并通過(guò)篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法 。原生質(zhì)體融合不僅能在不同菌株或種間進(jìn)行，還能做到屬間、科間甚至更遠(yuǎn)緣的微生物或高等生物細(xì)胞間的融合。 ? 適用范圍： 各種生物細(xì)胞都能進(jìn)行原生質(zhì)體融合，包括各種原核生物、真核微生物以及高等動(dòng)植物和人體的不同細(xì)胞。通過(guò)接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞就稱接合子。獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，稱轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 第 六 章 可轉(zhuǎn)化的性狀 莢膜多糖的合成 專一性酶的合成 專一性蛋白質(zhì)的合成 抗藥性 第 六 章 混合培養(yǎng) (二 )、轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction） （ 1952）在Salmonella typhimurium中發(fā)現(xiàn)的。 ?有關(guān)名詞： ?受體菌： recipient/receptor，轉(zhuǎn)化基因的接受者 ?供體菌 ： donor，轉(zhuǎn)化基因的提供者 ?轉(zhuǎn)化因子： 來(lái)自供體菌的 DNA片段 ?轉(zhuǎn)化子： transformant，將轉(zhuǎn)化基因重組進(jìn)入自身染色體組的重組子 (一 )、轉(zhuǎn)化（ transformation） 轉(zhuǎn)化及其發(fā)現(xiàn) 第 六 章 轉(zhuǎn)化 第 六 章 第 六 章 ① 受體細(xì)胞要處于感受態(tài) . ?感受態(tài) ： petence，受體細(xì)胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài) ②供體 DNA片段（ 轉(zhuǎn)化因子 ） 大小適宜，分子量一般為1 107 D 左右 ③菌株間的親緣關(guān)系密切 轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件 轉(zhuǎn)化的類型 根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為： ①自然遺傳轉(zhuǎn)化 natural geic transformation ② 人工轉(zhuǎn)化 artificial transformation 第 六 章 人工轉(zhuǎn)化 人工轉(zhuǎn)化 —— 是通過(guò)人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取 DNA的能力，或人工地將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 第 六 章 生長(zhǎng)快、產(chǎn)量低 生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量高 基因重組 生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高 第 六 章 細(xì)菌的基因重組 ?基因重組的方式 ?轉(zhuǎn)化 ?轉(zhuǎn)導(dǎo) ?接合 ?原生質(zhì)體融合 第 六 章 ?定義 ： 受體菌自然或在人工技術(shù)作用下直接攝取來(lái)自供體菌的游離 DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)化。 第 六 章 二、基因重組 ? 定義：凡把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過(guò)遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱為基因重組（ gene rebination）或遺傳重組。 第 六 章 環(huán)出效應(yīng) ? 即環(huán)狀突出效應(yīng)。這就說(shuō)明，過(guò)氧化氫很可能是 “ 自發(fā)突變 ” 中一種內(nèi)源性誘變劑。 ? 幾種自發(fā)突變的可能機(jī)制 ? 微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng) ? 過(guò)氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物。 ? 染色體間畸變 ：指非同源染色體間的 易位 。 ? 染色體內(nèi)畸變 ：只涉及一條染色體上的變化， ? 如發(fā)生染色體的部分 缺失 或 重復(fù) 時(shí)，其結(jié)果可造成基因的減少或增加； ? 如發(fā)生 倒位 或 易位 時(shí)，則可造成基因排列順序的改變，但數(shù)目卻不改變。 ?這類化合物都是平面型的三環(huán)分子，它們的結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤 — 嘧啶對(duì)十分相似。與染色體畸變相比，移碼突變也只能算是 DNA分子的微小損傷。 堿基轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制 —— 以亞硝酸為例 第 六 章 若干誘變劑的作用機(jī)制及誘變功能 誘變因素 在 DNA上的初級(jí)效應(yīng) 遺傳效應(yīng) 堿基類似物 摻入作用 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 羥 胺 與胞嘧啶起反應(yīng) GC→AT的轉(zhuǎn)換 亞硝酸 A、 G、 C的氧化脫氨作用 交 聯(lián) AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 缺失 烷化劑 烷化堿基（主要是 G） 烷化磷酸基團(tuán) 喪失烷化的嘌呤 糖 磷酸骨架的斷裂 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 AT→TA的顛換 GC→CG的顛換 巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位） 丫啶類 堿基之間相互作用 雙鏈變形 碼組移動(dòng)（＋或－） 紫外線 嘧啶的水合物 形成嘧啶的二聚體 交 聯(lián) GC→AT轉(zhuǎn)換 碼組移動(dòng)（＋或－） 電離輻射 堿基的羥基化核降解 DNA降解 糖 磷酸骨架的斷裂 喪失嘌呤 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 碼組移動(dòng)（＋或－） 巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位） 加熱 C脫氨基 CG→TA轉(zhuǎn)換 Mu噬菌體 結(jié)合到一個(gè)基因中間 碼組移動(dòng) 第 六 章 移碼突變 (frameshift mutation) ? 指誘變劑使 DNA分子中增加（插入）或缺失一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變。 對(duì)某一具體誘變劑來(lái)說(shuō)，即可同時(shí)引起轉(zhuǎn)換與顛換，也可只具其中的一種功能。 誘發(fā)突變的機(jī)制 第 六 章 堿基置換（ substitution） ? 定義 ：對(duì) DNA來(lái)說(shuō)，堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷（ microlesion），它只涉及一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換。 第 六 章 (二 ) 突變機(jī)制 誘變劑（ mutagen） ：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑 . 種類： 誘變劑的種類很多，作用方式多樣。 ?穩(wěn)定性： 變異性狀穩(wěn)定可遺傳 。 ?獨(dú)立性 ：各種突變獨(dú)立發(fā)生 ， 不會(huì)互相影響 。 ?自發(fā)性 ：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生 。（ dwarf clone, 侏儒菌落） 第 六 章 糖代謝能力的 變異 營(yíng)養(yǎng)成份的合成能力改變 第 六 章 第二節(jié) 細(xì)菌變異的機(jī)制 一、基因突變（ mutation ） 指生物體的表型突然發(fā)生的可遺傳的變化。 R型（ rough）菌落：菌落表面粗糙，枯干，邊緣不整齊。 ? 有些細(xì)菌還表