放線菌素d誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)-文庫(kù)吧資料
2025-03-28 04:24本頁(yè)面
【正文】 ，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細(xì)胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體（ apoptotic bodies），凋亡小體則為鄰近的細(xì)胞所吞噬。 凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬 。加入細(xì)胞裂解液 37 ℃ 溫育過(guò)夜 , 離心收集上清 , 苯酚、氯仿抽提 , 在上清液中加入 2倍體積乙醇在 20 ℃ 靜置過(guò)夜 , 離心 , DNA 沉淀用 TE 溶解，用 1 % 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。在熒光顯微鏡下，被 Hochest33258染色的正常細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為團(tuán)狀分布的致密濃染顆粒，二者區(qū)別明顯。 ? 在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察 。 ? 取 2滴細(xì)胞于潔凈的蓋玻片上 ， 自然干燥； ? 置蓋玻片于平皿內(nèi) ， 滴加 Hochest33258染液 ， 室溫下避光染色 20－ 30分鐘后 ， 蒸餾水洗滌 3次 ， 自然干燥 。 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡步驟 ? 向處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞加入放線菌素 D（ 1μ g/ml） ， 細(xì)胞 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12小時(shí)； ? 將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞收集到離心管中 ，2022rpm離心 810分鐘去上清收集細(xì)胞；用胰酶消化培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞 ， 再合并到離心管中 ， 再離心收集細(xì)胞 。 ? Hochest33258熒光染料能夠和 DNA特異結(jié)合，對(duì)正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞均能染色，受到紫外光激發(fā)可發(fā)出綠色熒光。 ? 細(xì)胞凋亡過(guò)程不同于壞死性死亡，凋亡過(guò)程中染色質(zhì)斷裂，細(xì)胞核碎裂成為核碎片，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞體積減小，細(xì)胞膜內(nèi)折，整個(gè)細(xì)胞通過(guò)起泡和發(fā)芽的方式形成一些大小不等的凋亡小體（ apoptotic bodies），并逐漸被細(xì)胞周?chē)耐淌杉?xì)胞所吞噬，細(xì)胞的內(nèi)容物沒(méi)有泄漏，不會(huì)引起周?chē)M織的炎癥反應(yīng)。 生物學(xué)意義： ? 細(xì)胞凋亡對(duì)于多細(xì)胞生物個(gè)體的胚胎發(fā)育、維持器官組織細(xì)胞數(shù)目相對(duì)平衡、自我平衡的保護(hù)以及抵御外界因素的干擾 都起著非常關(guān)鍵的作用 ： 蝌蚪尾的消失 ， 骨髓和腸的細(xì)胞凋亡 ， 脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育 ， 發(fā)育過(guò)程中手和足的成形過(guò)程 。凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。放線菌素 D誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察 ? 【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 ? 觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義 細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的由基因決定的自動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程，所以也常常被稱為細(xì)胞編程死亡（ programmed cell death,PCD）。 細(xì)胞死亡有兩種形式： ? 一種是壞死性死亡（ necrosis），是由于細(xì)胞外部理化因素的侵襲而造成的細(xì)胞崩潰裂解； ? 另外一種是凋亡（ apoptosis），是細(xì)胞在一定的生理或者病理?xiàng)l件下按照自身的程序結(jié)束其生存，是由基因決定的自動(dòng)結(jié)束生命
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