【正文】 關(guān)系。 ? RNAi將大大促進對這些新基因功能的研究。被俘獲的 DNA就會被導(dǎo)入培養(yǎng)的細胞。 轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（ biolistic particle）將 DNA， RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細胞質(zhì)或細胞核。 88 polybrene 帶正電的 DEAE葡聚糖或 polybrene多聚體復(fù)合物和帶負電的 DNA分子使得 DNA可以結(jié)合在細胞表面。 電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。 85 86 87 (三 )siRNA的轉(zhuǎn)染 將氯化鈣， RNA(或 DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含 DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。 4. siRNA表達載體 siRNA表達載體的優(yōu)點在于可以進行較長期研究 —— 帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。 以 DNA Oligo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成 siRNAs。激活的 RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離 siRNA3’ 端 12個堿基的位置切割 mRNA。 81 82 ? 在 RNAi效應(yīng)階段 siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（ RNAinduced silencing plex, RISC）。 ? 在起始階段 加入的小分子 RNA被切割為 2123核苷酸長的小分子干擾 RNA片段 (small interfering RNAs, siRNAs)。 ? 這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制 (posttranscriptional gene silencing, PTGS)被稱為 RNA干擾（ RNAi）。 ? 應(yīng)用反義核酸治療方法，人工合成反義DNA/RNA 抑制端粒酶的作用 。 ? 7脫氮 2脫氧腺 /鳥苷酸（ 7deazad A/GTP ）是潛在的端粒酶抑制劑，二者都可通過端粒酶的催化作用慘入到端粒 DNA中，由于它們的摻入使端粒過早地縮短，開僻了腫瘤治療的新途徑。 ? 哪么能否應(yīng)用抑制端粒酶的手段來治療腫瘤呢？ 這個問題正是目前人們關(guān)注的問題，也是研究的熱點。揭示，端粒酶可能是一個廣泛的腫瘤標(biāo)致，可用于腫瘤的診斷。 ? Zheng ，報道，婦科腫瘤中端粒酶活性增強的占 95%。 ? 在惡性腫瘤中，端粒酶活性明顯增高，以延長端粒，彌補因細胞分裂而造成的端?？s短，從而使細胞無限增殖惡化，甚至使癌細胞永生化。 ? Ligner解釋，“ 如果我們能夠讓這些蛋白在更早的時間發(fā)揮作用，或者我們能夠重新構(gòu)建一種類似的機制，癌細胞就不再永生化。這種蛋白復(fù)合物有點類似于蓋子，阻止端粒酶在端粒上發(fā)揮作用。在每次細胞分裂時，癌細胞與大多數(shù)細胞一樣丟失大約 60個核苷酸，但是活化的端粒酶給它補回一樣多的核苷酸，然后內(nèi)部時鐘被重置為零，它就永生化。但是細胞永生化在 90%已知的癌癥中是腫瘤形成的一個關(guān)鍵因素。這就是癌細胞永生化的形成機制。正常情況下，一旦胚胎發(fā)育階段結(jié)束，除了 成體干細胞 之外，體內(nèi)的細胞就停止產(chǎn)生端粒酶。 ? 細胞永生化 (cellular immortality)導(dǎo)致癌癥形成，而且重新具備在胚胎發(fā)育中的細胞才有的一種關(guān)鍵功能： 端粒 長度不縮短 。 64 ? 利用 TRAP（ Telemeric Repeat Amplification Protocol）技術(shù)檢測正常動物、植物細胞時發(fā)現(xiàn)，除個別增生活躍的組織有微弱的端粒酶活性外，其他組織都沒有端粒酶活性。 62 端粒合成機制 63 G1/S期 ， 端粒酶活性逐漸增高 S期 活性最高。 61 影響端粒長度的因素很多，其中主要有： ? ① 端粒結(jié)合蛋白 ? ② 端粒帽蛋白 ? ③ DNA復(fù)制酶 ? ④ 端粒酶等 ? 其中端粒酶是最主要因素。 ? 端粒被認為是細胞有絲分裂的“生物鐘”。 隨著細胞分裂的不斷進行，端粒逐漸縮短。 ? 每條染色體的末端含有一段被稱作 端粒 的特殊 DNA序列，它的長度受到端粒酶的調(diào)節(jié)。在人類大約有 12～ 15Kb，是非結(jié)構(gòu)基因，不編碼蛋白質(zhì)。 美國 3名科學(xué)家獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎， 2022。 57 發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護染色體的”。其端粒 DNA是富含 G的高度 保守的重復(fù)核苷酸序列。同時由于 “ 增變基因 ” 的作用 ,通過其一般突變率使其每一轉(zhuǎn)化成為可能 。即 DCC（ Deleted in colon cancer）的丟失突變有關(guān)。 約 50%的中、晚期腺瘤， 10%早期腺瘤有 Kras的突變 —— 與早、中期腺瘤演進有關(guān)。 51 五、癌的多階段演化（ multistep evolution） 腫瘤的發(fā)生 涉及多階 段、多基因 參與的復(fù)雜 過程，以結(jié) 腸直腸癌為 例說明其過 程： 52 癌的多階段演化 53 癌的多階段演化 5chr LOH DNA低甲基化 正常結(jié)腸細胞 C生長增強 早期腺瘤 APC kras基因激活 18 chrLOH LOH LOH 中期腺瘤 晚期腺瘤 癌 轉(zhuǎn)移 DCC 17chr 其它 chr 54 上述過程表明，正常細胞經(jīng)過多次遺傳損傷事件，涉及癌基因激活、抑癌基因失活多個 Gene的變化，經(jīng)過相應(yīng)的多階段演化 而形成惡性表型的過程 55 ? 在癌的演化中，不存在一個不變的突變序列，而可能是每個連續(xù)的階段都有一生長優(yōu)勢上的序列。定位于 1q32， 4個 exon,編碼 164個氨基酸。 ? nm23 Gene—— 17q21，編碼 17kd蛋白。 50 2）腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因 ? 又在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)， nm23基因 的表達與乳腺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 ? S100A4表達與人乳腺癌、結(jié)腸直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān) 。 ? 1989年從轉(zhuǎn)移性小鼠乳腺癌細胞中分離出一種與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因 —— S100A4(又稱為 CAL 、 p9ka、 mtsI)。 49 1）腫瘤轉(zhuǎn)移基因 ? 腫瘤轉(zhuǎn)移的遺傳基礎(chǔ)： ? 轉(zhuǎn)移相關(guān)的染色體 ： 10q雜合性丟失 浸潤性膀胱癌 ? 兩種 TSG定位 — — →→對腫瘤進展有促進作用。 47 4 .腫瘤轉(zhuǎn)移基因和轉(zhuǎn)移抑制基因 ? 某些腫瘤發(fā)展到一定階段可發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，包括癌細胞由原發(fā)性脫落，進入細胞外基質(zhì)和血管或淋巴管，并在遠處適宜的組織中生長。 ? N T LOH MI 46 ? MMR基因的作用方式類似于腫瘤抑制基因 . MMR基因功能喪失需要兩次突變事件。 43 人類 MMR基因定位： Gene location Exon ORF 產(chǎn)物 HMSH2 2p16 16 2802bp 934 aa HMLH1 19 2268bp 756 aa HPMS1 2q31q33 ? 2795bp 932aa HPMS2 2p22 ? 2586bp 862aa 44 人類 MMR系統(tǒng)與腫瘤 ? DNA 錯配修復(fù)基因的完整性對確保 DNA復(fù)制的精確性極為重要 。 42 目的 ? 從而有效地防止 DNA復(fù)制差錯的產(chǎn)生。 ①修復(fù)： 修復(fù) DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的堿 作用 基錯配。 38 A G N A T T C G T A MutS Mut H A G N A T T C G T A Mut L 39 40 另外，該系統(tǒng)還需要其它酶和因子參與 DNA聚合酶 Ⅲ ； 如： DNA連接酶； 單鏈結(jié)合蛋白； 外切酶等，從而共同完成修復(fù)反應(yīng)。 ? MutS—— 其蛋白的作用是識別錯配的堿基位點并與 之結(jié)合。 37 錯配修復(fù)基因（ mismatch repair gene ， MMR） ? DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)（ MMR首先是在原核生物中發(fā)現(xiàn) ) Mut S ? MMR系統(tǒng) Mut L 也稱 Mut SLH 途徑。 ? Fishel等克隆了人的這一同源基因， Muts,并定位于 2P，并迅速鑒定了另三個這樣基因。 ? 增變基因突變 會導(dǎo)致 100— 1000倍突變率的增加。 LOH DNA MI 35 增變基因 ? 1993年 Fishel在 yeast中發(fā)現(xiàn) ,并將 MutHLS基因稱為 mutater gene。 30 31 32 33 P53基因與其它基因間的相互作用 34 增變基因