外源基因的表達(dá)ppt課件-文庫吧資料
2025-01-23 17:10本頁面
【正文】 涵體熒光圖 包涵體的組成 蛋白質(zhì) 非蛋白質(zhì) 外源基因的表達(dá)產(chǎn)物： 占大部分，具有正確的氨基酸序列，但空間構(gòu)象錯誤，因而包涵體蛋白一般 沒有生物學(xué)活性 。 （ 2）外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物： ?存在部位： 細(xì)胞質(zhì) 、 細(xì)胞周質(zhì) 或 細(xì)胞外培養(yǎng)基 中； ?表達(dá)形式： 不溶性蛋白 和 可溶性蛋白 兩種。 PL和 PR表達(dá)系統(tǒng) ：是以 λ噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子 PL和 PR構(gòu)建的。 為了使外源基因高效表達(dá)，必須構(gòu)建作為基因表達(dá)受體菌的 大腸桿菌工程菌 。 因此，在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時，要考慮所表達(dá)基因的種類和性質(zhì)，或?qū)ν庠椿虻膲A基進行適當(dāng)置換，或?qū)寺≥d體上的調(diào)控序列進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。有的密碼子在一種基因組中使用的頻率高，被稱為 主密碼子 ，而在另一種基因組中使用的頻率較低，被稱為 罕用密碼子 。具報道，在大腸桿菌中以四個核苷酸組成的順式序列 UAAU作為 終止密碼 ，可有效地終止多肽鏈的合成。 在大腸桿菌中，合成多肽鏈的釋放由 RF1和 RF2兩個 釋放因子 所調(diào)控， RF1識別終止密碼 UAA和UAG， 而 RF2識別終止密碼 UAA和 UGA，由于UAA同時為兩個釋放因子所識別，一般被選作翻譯的終止密碼。 也有極少數(shù)生物利用其它密碼子作為翻譯的起始位點，如 GUG、 UUG等。 大腸桿菌 SD序列的堿基組成為 5 ′AGGAGG 3 ′,其中以 GGAG四個堿基最為重要，這四個堿基中的任何一個發(fā)生突變都會引起翻譯效率的大幅度下降。 SD序列與核糖體 16S rRNA特異配對而與宿主核糖體結(jié)合，它對 mRNA的翻譯起著決定性的作用。 例如： ?起始密碼子與 SD序列之間的距離： 6～ 8bp，多數(shù)為 7bp ?SD序列后面的堿基組成： 為 AAAA或 UUUU時，翻譯起始效率最高；為 CCCC或 GGGG是，翻譯起始效率分別為最高的 50%和 15%。 轉(zhuǎn)錄終止子的 功能 ： 一方面，它使轉(zhuǎn)錄在目的基因之后立即停止，避免多余的轉(zhuǎn)錄以節(jié)省宿主內(nèi) RNA的合成底物，提高目的基因的轉(zhuǎn)錄量； 另一方面，正常轉(zhuǎn)錄終止子的存在能夠防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，有效地控制目的基因mRNA的長度，提高 mRNA的穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上其它基因的異常表達(dá)。 理想的可調(diào)控的啟動子在細(xì)胞生長的初期往往不表達(dá)或低水平表達(dá)，而當(dāng)細(xì)胞增殖到一定的密度后，在某種特定的誘導(dǎo)因子（如光、溫度或化學(xué)藥物等）的誘導(dǎo)下， RNA聚合酶才開始啟動轉(zhuǎn)錄，合成 mRNA。在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可使抑制物失活，啟動子功能重新恢復(fù)。 因此，在構(gòu)建表達(dá)載體的時候一般采 用 強的啟動子 和 強的終止子 ，以達(dá)到高效表達(dá)的目的。當(dāng) RNA聚合酶 定位并結(jié)合到啟動子序列上時，便可啟動基因的轉(zhuǎn)錄。選擇可調(diào)控的 強啟動子 是構(gòu)建一個理想的表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問題。 ① 啟動子 啟動子（ promotor）： 是一段能被 宿主 RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合并指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的 DNA序列，是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件。 （ 2）外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) 這一系統(tǒng)包括 啟動子、抑制物基因 和 終止子 。這樣就可以篩除掉不含載體的宿主，同時保證載體在宿主中的穩(wěn)定存在。 大腸桿菌表達(dá)載體上一般都帶有一個以上的抗生素抗性基因。 微生物表型選擇標(biāo)記 顯性標(biāo)記 營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 在基因克隆中絕大多數(shù)的質(zhì)粒載體都是使用 抗菌素抗性記號 ，并且主要集中在 氨芐青霉素抗性 、 四環(huán)素抗性 、 鏈霉素抗性 、 氯霉素抗性 以及 卡那霉素抗性 等少數(shù)幾種抗菌素抗性記號上。 pSC101： 嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制型 ，每細(xì)胞質(zhì)?？截悢?shù)少于 5個。 大腸桿菌基因表達(dá)載體一般是 質(zhì)粒表達(dá)載體 ，含有能在大腸桿菌中有效復(fù)制的復(fù)制子。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性： ① 已經(jīng)掌握了十分豐富的有關(guān)大腸桿菌基礎(chǔ)生物學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等方面的 背景知識 ，特別是對其 基因表達(dá)調(diào)控 的分子機理有了深刻的了解； ②大腸桿菌已被發(fā)展成為一種 安全的 基因工程實驗體系，擁有各類適用的 寄主菌株 和不同類型的 載體系列 ； ③實驗已經(jīng)證明，許多克隆的 真核基因 都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實現(xiàn)有效的、高水平的表達(dá)； ④大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易于進行工業(yè)化批量生產(chǎn)。 一、大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌 —— 是一種 革蘭氏陰性細(xì)菌 ，其遺傳背景清楚，目標(biāo)基因表達(dá)的水平高，培養(yǎng)周期短。 不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象。 多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。 原核生物 作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞所具有的特點： 原核生物多為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。 外源基因表達(dá)系統(tǒng) 基因表達(dá)載體 受體細(xì)胞 基因表達(dá)系統(tǒng) 原核 生物基因表達(dá)系統(tǒng)： 如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。 ?mRNA只能在 細(xì)胞
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