【正文】 將 L－酪氨酸 懸浮于 10mL 蒸餾水中， 8 磅 20 分鐘滅菌，然后于 100mL無菌的營養(yǎng)肉湯瓊脂混合，傾倒平板，待凝固后，將測試菌接種于平皿上，培養(yǎng)7 到 14d，記錄酪氨酸結(jié)晶是否被水解而變透明。適溫培養(yǎng) 5 天，記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。待冷至 45－ 50℃時，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。 接種與觀察結(jié)果：接種待測菌株，適溫培養(yǎng) 7d 或 14d，按上述特征觀察和記錄牛奶產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固或胨化等反應(yīng)。 （ 5） 凝乳酶凝固――有些細菌能產(chǎn)生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此時石蕊常呈藍色或不變色。 （ 3） 胨化――細菌產(chǎn)生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶變得比較澄清。 細菌對牛 奶的作用有一下幾種： （ 1） 產(chǎn)酸――細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變紅。 2石蕊牛奶的反應(yīng) 牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。每株菌至少重復(fù)點接兩皿。 另一種方法： 以無菌操作取出卵黃，放入滅菌的三角瓶中，加相當于等量的生理鹽水搖勻后，取 10mL 卵黃液加入到溶化的約 50－ 55℃的 200mL 肉汁胨瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿，制 成卵黃平板，過夜后即可使用。 接種與觀察結(jié)果：將測試菌的菌液，環(huán)接在有卵黃的試管和不加卵黃的對照管中，適溫培養(yǎng) 3 或 5 天觀察。培養(yǎng)基要求十分澄清，接種時應(yīng)采用幼齡菌液，直針接種，適溫培養(yǎng) 3－ 7d，與未接種的對照管對比，目測生長情況。一般可根據(jù)不同種類的菌株，選擇其適合生長的培養(yǎng)基，在其中加入不同量的 NaCl，接種后觀察其生長與否，以判斷其耐鹽性。 1耐鹽性試驗 本試驗是觀察滲透壓對細菌生長的影響。 （ 3） 在菌懸液中加入 的 ，測定管置于 37℃水浴培養(yǎng)。 1β 半乳糖苷酶（ ONPG）的測定 本試驗應(yīng)用于腸肝菌科的鑒定。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對照。 1℃培養(yǎng) 18~24h，觀察結(jié)果。刮取適溫培養(yǎng) 18－ 24 小時的菌苔至 2mL 的葡萄糖酸鹽溶液中制成濃的菌懸液，置 30℃過夜，然后每管加入 的斐林試劑，放在沸水浴中加熱 10 分鐘，試管中液體由藍色變?yōu)辄S綠，綠橙色或出現(xiàn)紅色沉淀者為陽性反應(yīng)，如溶液不變色者為陰性。 試驗方法：用 的磷酸緩沖液配制成 含 1％葡萄糖酸鹽（可用葡萄糖酸鈉或葡萄糖酸鈣）的溶液。 1葡萄糖酸鹽的氧化 假單胞菌屬和腸道桿菌科的細菌，可氧化葡萄糖酸為 2－酮基葡萄糖酸。 如測定培養(yǎng)基生長并變藍色，表示可利用丙二酸鹽，為陽性結(jié)果。 許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，抑制了三羧酸循環(huán)。 1利用丙二酸鹽試驗 丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。 1檸檬 酸鹽或丙酸鹽的利用 某些細菌能利用檸檬酸鹽或丙酸鹽作為碳源，及磷酸胺作為氮源，將檸檬酸分解為二氧化碳，則培養(yǎng)基中由于有游離鈉離子存在而呈堿性。 1℃培養(yǎng) 1~6 天。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至 6 天。 試驗方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36177。對照管應(yīng)呈黃色反應(yīng)。腸肝菌科的細菌于 37℃培養(yǎng) 4 天觀察。 接種與觀察結(jié)果：用幼齡培養(yǎng)液作為菌種，直接接種。此反應(yīng)在偏酸的條件下進行。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。 1℃培養(yǎng) 18~24h，觀察結(jié)果。 實驗證明靛基質(zhì)試劑可與 17 種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或 5甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。 試驗方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗培養(yǎng)基管，于 36177。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。α 萘胺具有致癌性、故使用時應(yīng)加注意。 用α 萘胺進行試驗時，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。 注：對于糖醇類發(fā)酵現(xiàn)在一般用糖、醇類細菌微量生化鑒定管在 36℃ 18－24h 即可出結(jié)果。 本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進行各種細菌的鑒別，因而每次試驗，常需 同時接種多管。 176。 試驗方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。 糖或醇類發(fā)酵試驗 不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或 不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。 （ 2）結(jié)果觀察：氧化型產(chǎn)酸――僅開管產(chǎn)酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿（ 1－ 2d），后來才稍變酸。另 2 管不封油為開管，同時還要有不接種的閉管作對照。也可利用這一基礎(chǔ)培養(yǎng)基來測定細菌從其他糖類或醇類產(chǎn) 酸的能力。這一試驗廣泛用于細菌鑒定。氧化型產(chǎn)酸量較少，所產(chǎn)生的酸常常被培養(yǎng)基中的蛋白胨分解時所產(chǎn)生的胺所中和，而不表現(xiàn)產(chǎn)酸。細菌對糖類的利用有 2 種類型： 1 種是從糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，不需要以分子氧作為最終受氫體，稱發(fā)酵型產(chǎn)酸；另一種則以分子氧作為最終受氫體，稱氧化型產(chǎn)酸。假若兩種培養(yǎng)基上生長情況差別不明顯，開在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種 3 次，如差別仍不明顯則以陰性論。每一測定菌必須接種未加碳水化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對照。 接種和觀察結(jié)果：菌種最好做成懸液，避免帶入少量碳源干擾試驗結(jié)果。因碳氫化合物不溶于水，可在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，或加入到 45℃的固體培養(yǎng)基中 ，振蕩后立即倒成平板?？捎糜跍y定的底物種類很多，有單糖、雙糖、糖醇、脂肪酸、羥基酸及其他有機酸、醇、各種氨基酸類胺類以及碳氫化合物等?，F(xiàn)介紹 1 種合成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有些細菌還可適當補加各種維生素。 含碳化合物的利用 細菌能 否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否產(chǎn)生代謝這種化合物的有關(guān)酶系，因而作為鑒定依據(jù)。 本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。 ３）快速法：將 %肌酸溶液 2 滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入 5%α 萘酚 3 滴， 40%氫氧化鈉水溶液 2 滴，振動后放置 5min，判定結(jié)果。 1176。 C 培養(yǎng) 4 天、培養(yǎng)液 先加入 5176。 ２） Barritt 氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于 36177。亦有主張在 48~50176。 1176。 1176。 VP 試驗 某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱 V－ P（ +）反應(yīng)。 甲基紅為酸性指示劑， pH 范圍為 ~，其 pK 值為 。 C 較好） 3~5 天，從第二天