【正文】 花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 出原花青素的提取率。 分別 取 不同濃度的 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液 ，加入香草醛 甲醇溶液 6mL， 搖勻，再加入 濃鹽酸 3mL，混合均勻 ， 每組三個平行 ， 避光反應(yīng) 4h。 原花青素的測定 采用濃鹽酸 香草醛比色法測定原花青素的含量 [37]。 （ 4） 超聲功率 準(zhǔn)確地稱量 刺五加籽粉于 100mL 的小燒杯中，加入 50mL 濃度為50%的乙醇溶液，分別在 100W、 200 W、 300 W、 400 W、 500 W 的超聲波作用 20min。 （ 2） 料液比 準(zhǔn)確地稱量 刺五加籽粉于 100mL 的小燒杯中，加入 40mL 濃度為50%的乙醇溶液使得料液比為 1:10； 準(zhǔn)確地稱量 刺五加籽粉于 100mL的小燒杯中，加入 60mL 濃度為 50%的乙醇溶液使得料液比為 1:20； 準(zhǔn)確地稱量 刺五加籽粉于 100mL 的小燒杯中，加入 60mL 濃度為 50%的乙醇溶液使得料液比為 1:30； 準(zhǔn)確地稱量 刺五加籽粉于 100mL 的小燒杯中，加入 80mL 濃度為 50%的乙醇溶液使得 料液比為 1:40；準(zhǔn)確地稱量 刺五加籽粉于 100mL 的小燒杯中，加入 50mL 濃度為 50%的乙醇溶液使得料液比為 1:50；準(zhǔn)確地稱量 刺五加籽粉于 100mL 的小燒杯中，加入 60mL 濃度為 50%的乙醇溶液使得料液比為 1:60；在 200W 的超聲波作用 20min。 提取 單因素實驗 用超聲輔助提取原花青素主要考慮到乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲功率的影響 ，分別對這些條件進行單因素實驗，優(yōu)化原花青素的提取率。設(shè)定超聲時間和超聲功率，進行超聲波輔助浸提。 試劑與藥品 表 試劑與藥品 名稱 種類 生產(chǎn)廠家 香草醛 分析純 天津 市大茂 化學(xué)試劑 廠 無水乙醇 分析純 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司 鹽酸 分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 甲醇 分析純 北京化工廠 石油醚 分析純 北京化工廠 兒茶素 分析純 成都曼斯特生物科技有限公司 結(jié)晶硫酸鎂 分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠 氯化鉀 分析純 北京化工廠 無水氯化鈣 分析 純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公 司 硫酸銅 分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠 儀器與設(shè)備 大連工業(yè)大學(xué) 2020屆本科生畢業(yè)論文 13 表 儀器與設(shè)備 設(shè)備名稱 生產(chǎn)廠家 DKS26型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司 722S 分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司 NJL075超聲波細胞粉碎機 南京杰全微波設(shè)備有限公司 XT350A型高速搖擺粉碎機 浙江永康市紅太陽機電有限公司 電子天平 上海友聲衡器有限公司 真空 抽濾機 科大創(chuàng)新股份有限公司 實驗方法 原料的預(yù)處理 將實驗室釀酒剩余的刺五加殘渣烘干，去皮去梗 后得到刺五加籽，粉碎，用一定比例的石油醚浸泡一段時間，抽濾，脫脂后的刺五加籽粉保存?zhèn)溆?。探討刺五加的綜合利用途徑，在廢棄的刺五加殘渣中提取 一些有價值、有生理活性的功能性成分， 這不僅能使廢棄的天然有機化學(xué)資源得到合理的研究、開發(fā)、利用，進一步增加刺五加 的附加值，而且還有利于環(huán)保，具有重要的經(jīng)濟價值和廣闊的市場前景。刺五加廢 渣中含有較多的碳水化合物、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，然而如果 不好好處理將會有大量的微生物繁殖生長，使其腐爛，產(chǎn)生酸味、臭味，還會招引來蒼蠅，給周圍的環(huán)境帶來嚴(yán)重的污染。 并進行穩(wěn)定性研究 ，主要研究光照、溫度、金屬離子對刺五加穩(wěn)定性的影響。該方法萃取能力強，溶解力大，效率高，但是由于設(shè)備昂貴，推廣使用比較困難 [36]。 呂麗爽等人 用微波輔助的方法從葡萄籽中提取原花青素，原花青素的提取率遠遠超過了傳統(tǒng)的水提法，這表明該工藝具有快捷、高效的特點 [35]。 微波輔助提取 是將 傳統(tǒng)有機溶劑萃取 與微波技術(shù) 相結(jié)合的一項新型萃取技術(shù) ， 分子偶極高速旋轉(zhuǎn)運動轉(zhuǎn)換為熱能 ，這種熱能對介質(zhì)進行加熱，同時還使微波穿透到介質(zhì)的內(nèi)部，形成獨特的加熱方式 。例如，李瑞麗，喬五忠，王艷輝等用超聲輔助提取技術(shù)對 葡萄籽中原花青素的 提取 進行了研究，在單因素實驗和正交實驗的基礎(chǔ)上，得出最佳工藝條件為：在 40℃下， 料液比為 1:40， 乙醇溶液 為 40%， 超聲功率 120 W，超聲時間 10min[34]。 超聲波提取法的優(yōu)點是操作簡單，提取效率高，而且無污染，因此有很好的運用前景。 超聲輔助 提取法 超聲波提取法是一種物理物理的破碎過程，就是對樣品中要提取的部分進行超聲 強化處理。 回流法是通過不斷回流原料和大連工業(yè)大學(xué) 2020屆本科生畢業(yè)論文 10 溶劑互溶物來提高提取率。浸漬法是將原料置于有蓋容器中，加入規(guī)定量溶劑蓋嚴(yán)，浸漬一定時間，使有效成分浸出，此法簡單但有效成分不易完全浸出。 這四種有機溶劑對原花青素有很好的溶解性，由于乙醇價格低廉，來源豐富，毒副作用小，所以常選乙醇作為提取溶劑。 有機溶劑 水提 取法 有機溶劑萃取法是目前使用最為廣泛的方法之一， 根據(jù)相似相容原理，即各組分在溶劑中的溶解度不同，選用對原花青素溶解度大而對無效成分不容或少溶的溶劑從而將原花青素溶解出來。 水溶液浸提法 原花青素在植物體內(nèi)通常是以結(jié)合態(tài)存在，與纖維素、蛋白質(zhì)以氫鍵結(jié)合在一起，沸水可以使氫鍵斷裂，從而達到提取原花青素的目的。 用于其它食品 ： 利用原花青素的抗氧化性質(zhì)，應(yīng)用于火腿等肉制品可防止變色和氧化變味；應(yīng)用于糕點類可防止 油炸糕點的光氧化；應(yīng)用于發(fā)酵食品防止葡萄酒等的變味；應(yīng)用于調(diào)味料亦可防止其氧化變味。 用于魚肉加工產(chǎn)品 ： 可防止咸鮭魚、紅魚的褪色和變味，鮭魚的主要大連工業(yè)大學(xué) 2020屆本科生畢業(yè)論文 9 呈色物質(zhì)是蝦青素，咸鮭魚在冷藏或冷凍保存中蝦青素會氧化降解而造成紅色消失。在維生素 B2 溶液中添加 %的原花青素后，在紫外燈下照射，觀察 到原花青素的防止光氧化效果十分顯著。 目前其在食品中主要是作為天然抗氧化劑、保健食品原料及營養(yǎng)強化劑來使用，具體表現(xiàn)在以下幾個方面 [32]。 （ 3）食品 領(lǐng)域。結(jié)果表明，原花青素的治療作用與其清除自由基的能力 密切相關(guān)， 原花 青素所具有的強力抗氧化活性和清除自由基的能力是它在 化妝品領(lǐng)域使用的基礎(chǔ) 。 （ 2）化妝品 領(lǐng)域。 原花青素對血管疾病的治療價值在 20 世紀(jì) 80 年代初即已被人所承認(rèn)。 原花青素的應(yīng)用 原花青素的血管活性、抗彈性酶活性及抗氧化活性使其在藥品、化妝品、食品等 領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用。 （ 4）紫外分光光度法 ： 原花青素是無色物質(zhì)，在可見光區(qū)無特征吸收峰，而在紫外區(qū)有唯一特征吸收峰，最大吸收波長在 280nm處。 （ 3）高效液相色譜測定法 ： 該方法是 以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合 溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析 。通常用鐵鹽催化比色法測定總量，利用硫酸高鐵的催化作用，以鹽酸水解將之變?yōu)榧t色的花青素，花青素在 550nm處有最大吸收峰，比色測定其吸光值，與原花青素化學(xué)對照品比較，便可定量計算出樣品中原花青素的含量。 （ 2）鐵鹽催化比色測定法 ：原花青素素是植物王國中 廣泛存在的一類黃烷 3醇衍生物的總稱，因聚合度的不同以及單體構(gòu)象或鍵合位置的不 同可形成多種化合物。 測定原理是：原花青素上 的 A 環(huán)較為活潑 ，在酸性條件下 ， 其上的間苯二酚或 間苯三酚 會 與香草醛發(fā)生縮合 縮合 ， 生成在 500nm處有最大吸收的有色物質(zhì)，可通過比色法測其含量。 常見的測定方法有：香草醛 強酸法 、鐵鹽催化比色測定法、高效液相色譜測定法 、紫外分光光度法 等。在對 200 名進士視網(wǎng)膜非炎性患者服用原花青素，每天服用 150mg共兩個月，結(jié)果受試者視力有明顯的改善。故在歐美國家原花青素有“皮膚維生素”、“口服化妝品”的美譽。另 外 能 夠 抑制由紫外線 照射 引起的色素沉著，從而 使皮膚更加白凈。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：照射加原花青素的腫瘤抑制率明顯高于未加原花青素單純照射組 ，說明原花青素可抑制由輻射所引發(fā)的的脂質(zhì)過氧化 [27]。 研究證明：原花青素對多種癌細胞的基因突變有不同程度的抑制作用，其作用機理可 能與有絲分裂的信號傳導(dǎo)改變、細胞周期阻滯，從而抑制細胞生長及誘導(dǎo)細胞凋亡等有關(guān) [26]。作為一種抗氧化劑和抗誘變因素，原花青素能使致癌物質(zhì)毒性降低或消失，還能通過誘導(dǎo)細胞分化抑制癌癥的發(fā)展，對癌癥發(fā)展的 3 個階段具有明顯的抑制作用。 自由基和過氧化是導(dǎo)致心血管疾病非常重要的原因，原花青素 可以透過血腦屏障，對腦細胞能提供抗氧化的保護作用，故有預(yù)防早老年癡呆作用，并能穩(wěn)定血腦屏障，使有害物質(zhì)無法進入大腦而對 大腦起到保護作用 [25]。另外 OPC 能降低血液中的膽固醇水平，減少血管上膽固醇的沉積，以及抑制血管緊張素酶活性以降低血壓。 （ 2）降低血壓和保護心腦血管 ： 隨著人年齡的增長，血管中彈性纖維因逐漸氧化而變硬，這是導(dǎo)致老年人高血壓的主要原因。 大量研究表明 ，原 花青素是很強的抗氧化劑，能顯著清除自由基并能 抑制脂質(zhì) 被過氧化 ，它 可保護 VE 的生理活性、延緩其氧化消耗 。 （ 1） 抗氧化 、 清除自由基、 抗衰老作用 ： 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及營養(yǎng)保健學(xué)認(rèn)為，體內(nèi)自由基過多可直接引起多種疾病或和多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如消化、炎癥、呼吸、泌尿、 血液、內(nèi)分泌等系統(tǒng)的疾病都與自由基的作用密切相關(guān)。 原花青素的 生理 功能 原花青素是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑之一，它的抗氧化能力是維生素 E 的 50 倍以上，是維生素 C 的 20 倍以上。聚合度不同穩(wěn)定性不同，低聚原花青素具有一定的耐光、耐熱性，而高聚原花青素卻很容易凝聚沉淀。 原花青素 可以 與蛋白質(zhì) 結(jié)合，把其放入口腔中人可以感覺到澀味， 這是由于原花青素與口腔中的唾液蛋白結(jié)合， 因此原花青素具有 鞣性或收斂性 。 較多的羥基使得原花青素成為很好的供氫體，這樣原花青素就有很好的抗 氧化的性質(zhì)。 由于原花青素結(jié)構(gòu)含有不對稱的碳原子，因此具有旋光性 [19]。 在各種原花青素種類中，二聚體分布最廣，研究也是最多，二聚體是一類最重要的原花青素。 OPC 是水溶性的，擁有強有力的抗氧化能力，在體內(nèi)其抗氧化、清除自由基的能力 很強 ，并吸收迅速完全，口服 20min 即可達到最高血濃度，代謝半衰期約為 7h。根據(jù)聚合度的不同，通常將二至四聚體稱為低聚原花青素，簡稱 OPC。 1961 年，德國 Karl 等從英國山楂新鮮果實的乙醇提取物中首次分離出 2 種多酚化合物； 1967 年，美國 Joslyn 等又從葡萄皮和籽提取物中分離 4 種多酚化合物，他們所得到的多酚化合物在酸性介質(zhì)中加熱均可產(chǎn)生花青素， 故將此類多酚化合物命名為原花青素 [17]。 1995年末，美國 Whole Foods 雜志舉行了由公眾自由投票選舉自己信賴的植物藥的民意測驗，在未設(shè)候選藥物的情況下， %的選票集中在 10 種植物藥名下，其中原花青素被認(rèn)為是最受美國公眾青睞并風(fēng)靡美國草藥市場的植物藥。 原花青素概述 原花青素 （ Proanthocyanidins 或 Procyanidins，簡稱 PC），是植物王國中 廣泛存在的一大類聚多酚類化合物的總稱 ，廣泛地存在于各種植物的核、大連工業(yè)大學(xué) 2020屆本科生畢業(yè)論文 4 皮、種 籽中 ，葡萄籽中的原花青素含量最高，種類豐富 。 用李司忒氏菌感染小鼠，然后注射刺五加提取液 ， 免疫力明顯增強， 所以認(rèn)為它有提高機體腸道桿菌的能力 。 （ 4）抗菌消炎的作用 ：刺五加對切除腎上腺的小鼠，在夏、秋和冬季可減輕熱性發(fā)炎性水腫，在春季 有消炎作用。 （ 3） 抗衰老：衰老是人體各器官功能開始逐步降低的一種生理現(xiàn)象 ，是一個緩慢的過程，是一種不可避免的自然規(guī)律。 鄭日男等 人 對剌五加對人體免疫機制的作用進行了研究。另外，刺五加多糖對重建 B 細胞有較好的效果， 并且能夠使白細胞減少的情況有所改善。 （ 2）提高免疫力作用 刺五加多糖和刺五加苷類均能明顯 提高人體免疫能力。 從 刺五加中分得的糖苷給大鼠口服 22d，劑量為 50 mg/()， 服藥第 8 日起進行 負(fù)荷游泳試驗，共進行 8 次 試驗 ，在第 6 次游泳試驗中大鼠即表現(xiàn)出顯著的抗疲勞作 用。 （ 1）抗疲勞作用 實驗表明刺五加提取物 具 有 明顯的 抗疲勞作用 。 李筱玲等測得刺五加葉中含有 16 種氨基酸，其中 7種為必需 氨 基酸 ， 并且 天門冬氨酸 和 谷氨酸 的 含量較高 [10]。孟繁磊 、陳瑞戰(zhàn) 等人采用正交試驗優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù) ，用苯酚 硫酸法測定刺五加多糖含量 ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：70℃的提取溫度， 90min 的提取時間， 500W 的提取功率為最佳的提取條件，同時研究發(fā)現(xiàn)刺五加多糖具有一定的抗氧化活性，能清除有機自由基 [9]。 研究證明，黃酮類化合物具有抗自由基抗氧化、抗癌 、抗病毒、抗炎癥、抗過敏、抗糖尿病并發(fā)癥等多種生理活性及藥理作用，且無毒無害，對入類的腫瘤、衰老、心血管病等退行性疾病的治療和預(yù)防有重要意 義 [8]。 刺五加