【正文】 單一的條帶，大約為 1300 bp， 將片段回收，連接至 T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室初步驗(yàn)證正確后送上海英杰公司測(cè)序。從圖 12 來(lái)看，提取的樣品已無(wú) DNA 的污染。 OD260/OD280處的吸光度比值接近 ，說(shuō)明也沒有蛋白質(zhì)的重大污染，故用此法所提總 RNA 純度較好，所以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。當(dāng) OD260/OD280比值小于 時(shí)，可能有蛋白 表 15 總 RNA 比色測(cè)定結(jié)果 紫外比色及比值 樣品名稱 紅肉蜜柚 琯溪蜜柚 RNA 的含量 ng/μL ng/μL OD260/OD280 OD260/OD230 質(zhì)污染； OD260/OD230比值小于 時(shí)， RNA 樣品可能還有其它如酚類化合物的干擾物存在 [12]。樣品經(jīng)電泳檢測(cè)表明，提取出總 RNA 能清楚地看到 28S rRNA 和 18S rRNA 兩條 RNA 條帶，提取的 RNA 完整，沒有發(fā)生降解。 4 結(jié)果與分析 RNA 電泳結(jié)果分析 RNA 樣品的凝膠電泳分析是判斷 RNA 質(zhì)量的一種重要手段，從電泳膠上 28S rRNA 和 18S rRNA 的完整性可以判斷 RNA 有無(wú)降解及降解程度，也可以判斷有無(wú)DNA 污染。使 用自制 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂板于 Amp 抗生素的 LB 培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，于含 Amp 抗生素的液體 LB 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒 ，鏈接產(chǎn)物 。 T載體 連接 、轉(zhuǎn)化 按如下反應(yīng)體系于 16 ℃ 進(jìn)行連 接反應(yīng)： pUCmT μL， DNA 連接酶緩沖液1 μL， T4 DNA 連接酶 1 μL，回收產(chǎn)物 μL。 表 14 PSY 基因 PCR 擴(kuò)增體系 紅肉蜜柚（ μL） 琯溪蜜柚（ μL） ddH2O 10PCR Buffer(含 Mg2+) dNTPs 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 8 模板 1 1 P13 P14 Pfu Taq total 25 25 PCR 循環(huán)條件 ： 94 ℃ 預(yù)變性 4 min 后， 94 ℃ 50 s， 50 ℃ 50 s， 72℃ 90 s， 35 個(gè)循環(huán)， 72 ℃ 延伸 10 min， 5 ℃ 保存。 cDNA 第二鏈合成 反應(yīng)體系及程序如下： 表 13 cDNA 第二鏈合成 紅肉蜜柚（ μL） 琯溪蜜柚（ μL） 10PCR Buffer 5 5 dNTPs Taq DNA 聚合酶 1 1 模板 cDNA 3 3 ddH2O total 50 50 PCR 循環(huán)條件： 95 ℃ 預(yù)變性 1 min 后， 95 ℃ 15 s， 65 ℃ 30 s， 68 ℃ 6 min， 28個(gè)循環(huán)， 68 ℃ 延伸 7 min， 4 ℃ 保存。A (10 uM) 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 7 SMART Oligo(10 uM) ddH2O 表 11 cDNA 第一鏈合成 70 ℃ 溫育 5 min 后，立即轉(zhuǎn)到冰上放置 5 min； 表 12 cDNA 第一鏈合成 紅肉蜜柚 （ μL） 琯溪蜜柚 （ μL） 5RT Buffer 5 5 539。 表 11 cDNA 第一鏈合成 紅肉蜜柚 （ μL） 琯溪蜜柚 （ μL） RNA（ 2 ug） 1 339。AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT339。 (N = A， C， G or T； V = A， G or C) 539。 SMART? CDS Primer II A： 539。AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG339。 總 RNA 含量與純度測(cè)定 取 1 μL總 RNA 樣品，于紫外分光光度計(jì)上測(cè) OD230， OD260， OD280根據(jù)比值分析 RNA 純度及含量。反應(yīng)結(jié)束按如下操作處理： ① 加 DEPC ddH2O 補(bǔ)足至 300 μL， 加等體積酚 /氯仿 /異戊醇抽提，離心； ② 上清液再加等體積氯仿 /異戊醇抽提一次； ③ 加入 1/10 V NaAc， 2 V 無(wú)水乙醇，混勻， 70 ℃ 沉淀 20 min； ④ 4 ℃ ， 12020 rpm 離心 15 min； ⑤ 沉淀用 70 %乙醇漂洗； ⑥ 晾干，溶于 20 μL的 DEPC ddH2O。 ① 取 mL 提取液（提取液配方為 M Tris， M NaCl， 15 mM EDTA， % SDS， 1 % ?巰基乙醇， pH ），加 1 g 果肉（液氮研磨），混勻，室溫放置 5 min，加入 mL Tris 飽和酚，混勻，室溫放置 3 min； ② 加入 mL 氯仿，混勻，室溫放置 3 min； ③ 加入 mL NaAc，混勻，冰上放置 15 min， 4 ℃ ， 10000 rpm 離心 20 min； ④ 上清液轉(zhuǎn)至新的離心管中，加入等體積酚 /氯仿 /異戊醇（ 25： 24： 1）抽提； ⑤ 上清液轉(zhuǎn)至新的離心管中，加入等體積氯仿 /異戊醇（ 24： 1）抽提； ⑥ 上清液移至新的離心管中，加入等體積異丙醇， 70 ℃ 沉淀 20 min； ⑦ 沉淀用 1 mL DEPC ddH2O 溶解，加入 1/4 V LiCl 混勻，冰上放置 2 h（如有不溶雜質(zhì)，在加 LiCl 前要離心去除）； ⑧ 4 ℃ ， 10000 rpm 離心 20 min，沉淀用 1 mL DEPC ddH2O 溶解，加入 1/4 VLiCl混勻，冰上放置 2 h 以上； 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 6 ⑨ 離心，沉淀用 mL DEPC ddH2O 溶解； 加等體積酚 /氯仿 /異戊醇、氯仿 /異戊醇各抽提一次，上清液加入 2 V 無(wú)水乙醇， 1/10 V NaAc， 70 ℃ 沉淀 20 min； ⑩ 離心，沉淀用 70 %無(wú)水乙醇漂洗，室溫晾干，最后視沉淀的量加入 50~100 μL DEPC ddH2O 溶解。 ③ 研缽：清 洗干凈，用錫泊紙包裹， 180 ℃ 烘烤 6~8 h。 ⑦ 70 %乙醇：取 30 mL 的 DEPC ddH2O 至 70 mL 無(wú)水乙醇中（ DEPC ddH2O需先高壓滅菌處理）。 主要儀器和設(shè)備 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，電泳儀，電熱恒溫水浴鍋， PCR 儀，烘箱等。 2 材料 植物材料 成熟紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚果實(shí)由福建省農(nóng)科院提供。前人在溫州蜜柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的研究，已經(jīng)明確在 ?隱黃質(zhì)的積累起關(guān)鍵作用的主要是位于類胡蘿卜素生物合成途徑上游的 PSY 基因，而非下游的 BCH 基因 [9]。因此， PSY 基因是應(yīng)用植物基因工程改善轉(zhuǎn)基因植物中類胡蘿卜素含量的首選目的基因。類胡蘿卜素生物合成的第一步是由八氫番茄紅素合成酶 [5~7]。因此類胡蘿卜素既是影響果實(shí)外觀品質(zhì)和花卉觀賞價(jià)值的重要因素，也是決定水果、蔬菜內(nèi)在營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)。紅肉蜜柚也是目前國(guó)內(nèi)外已選育出的紅肉類型柚中果形最大，品質(zhì)最優(yōu)，成熟期早呈色最紅、有益天然色素含量最高的品種，其開發(fā)前境較大。經(jīng)專家 3 年實(shí)地跟蹤驗(yàn)證，認(rèn)為該品種具備新穎性、特異性、一致性和穩(wěn)定性，并于 2020 年正式通過(guò)了專家組的品種認(rèn)定，正式命名紅肉蜜柚 [3]。紅肉蜜柚源自琯溪蜜柚芽變， 是 平和縣小溪鎮(zhèn)厝丘村果農(nóng)林金山于 1988 年在自家果園發(fā)現(xiàn)的優(yōu)良芽變株 [2]。 gene isolationing。 guanxi sweet pummelo。比較發(fā)現(xiàn)，紅肉蜜柚和琯溪蜜柚果肉 PSY 基因全長(zhǎng)均為 1317 bp，編碼 439 個(gè)氨基酸，序列比對(duì)結(jié)果顯示兩者 PSY 基因與柑桔屬 PSY 基因同源性都相對(duì)較高，同源性最高達(dá) 99 %。 作者簽名： 日 期： 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 2 目 錄 摘要 ..................................................................................................................................... 1 英文摘要 ............................................................................................................................. 1 1 引 言 ............................................................................................................................... 1 2 材料 ............................................................................................................................... 2 植物材料 ................................................................................................................ 2 實(shí)驗(yàn)試劑 ................................................................................................................ 2 主要儀器和設(shè)備 .................................................................................................... 2 3 方法 ............................................................................................................................... 3 總 RNA 提取 ......................................................................................................... 3 常用試劑配制 ..................................................................................................... 3 器具處理與準(zhǔn)備 ................................................................................................. 3 提取 RNA ........................................................................................................... 3 RNA 的純化 .......................................................................................................... 4 RNA 提取質(zhì)量與含量檢測(cè) .................................................................................. 4 總 RNA 的電泳分析 .......................................................................................... 4 總 RNA 含量與純度測(cè)定 .................................................................................. 4 cDNA 鏈合成 ........................................................................................................ 5 cDNA 一鏈的合成 ............................................................................................. 5 cDNA 第二鏈合成 ..................................................................