20xx性別鑒定計(jì)-文庫吧資料
2025-01-17 00:46本頁面
【正文】 擇：引物3’端需與模板DNA嚴(yán)格配對，不能有任何修飾，3’端的錯配則會影響DNA聚合酶的有效起始；最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對；最后1～2個(gè)堿基（nt）最好不要用T/A，因?yàn)門/A之間只有兩個(gè)氫鍵，引物與模版結(jié)合不牢固。
，而前引物序列為 ttccaatccattcctttcctttcgcttgc，序列長度是28bp，℃；而后引物序列為
ggatagtaatggactggagtgaaatggac，序列長度是29bp，℃。延伸時(shí)間（Y s）取決于目的基因的長度，目的基因越長，延伸時(shí)間越長。
，分別是復(fù)性溫度（X℃）、延伸時(shí)間（Y s）、和循環(huán)次數(shù)（Z Cycles）。
，每桌可配成master后分裝，這樣可以保證加樣量比較均一和準(zhǔn)確，此外，每桌設(shè)置一個(gè)陰性對照和一個(gè)陽性對照。泳道16沒有299bp的條帶可能是因?yàn)镈NA模版沒有加進(jìn)PCR反應(yīng)體系。除泳道16外，其他上樣孔在250bp靠上的位置均存在299bp的條帶，有的條帶深有的條帶淺，可能是由于在取樣過程中用牙簽刮取的口腔上皮細(xì)胞量不同，導(dǎo)致所提取的DNA量不同，PCR擴(kuò)增的片段的量也就不同了，也有可能是上樣過程中點(diǎn)樣量存在差異而導(dǎo)致最終條帶亮度不同。圖12的泳道114除了在100bp處有條帶之外，在其上方也有較弱的條帶，可能是操作過程中引入了DNA雜質(zhì)而導(dǎo)致樣品不純。
女生的上樣孔為圖11的泳道11122和圖12的泳道114。
除DL2000 DNA marker的上樣孔外，其他上樣孔在100bp處都有或深或淺的條帶，此處的條帶是引物自身配對所形成的引物多聚體，條帶深可能是因?yàn)椋孩偕蠘恿肯鄬^多；②所配總反映體系時(shí)沒有充分混勻，導(dǎo)致分裝過程中引物含量相對較多；③引物自身形成二聚體的量過多。
圖11的泳道13，圖12的泳道5是加入的樣品是陰性對照，陰性對照組PCR反應(yīng)體系不加模版，在100bp處有引物多聚體的條帶，對女生的電泳結(jié)果起對照作用。DL2000 DNA marker的條帶大小由上至下分別是2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp。
2．結(jié)果
Y染色體特異性重復(fù)序列煩人DNA的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖1所示。
（10）啟動電泳，待觀察到負(fù)極有氣泡升起方可離開。電泳槽紅色電極為正極，與電泳儀正極相連。
（8）選擇合適的電壓（100V）和時(shí)間（20min）。
（6）將上述混合好的DNA樣品，按照表3的順序，點(diǎn)樣到凝膠中。
（4）在20μL PCR反應(yīng)液中加入4μL上樣緩沖液，用微量移液器吹吸混勻。輕
旋瓶蓋，放入微波爐中加熱沸騰3～4次，至溶液澄清無顆粒。
%的瓊脂糖凝膠電泳
（1）正確組裝1套制膠槽、制膠板、樣品梳（使用2排25齒的梳子）。
（8）12,000rpm離心除模版外PCR反應(yīng)體3min，獲得DNA溶液。陰性對照不加模板
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