【正文】 燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書(shū) 16 參考文獻(xiàn) [1] 陳大元 . 受精生物學(xué) [M]. 北京 科學(xué)出版社 , 2020,51: 147148. [2] 王海 , 曾申明 , 朱士恩 . 培養(yǎng)介質(zhì)、卵丘細(xì)胞和卵泡直徑對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響 [J]. 中國(guó)畜牧雜志 , 2020, 38: 1516. [3] 錢(qián)云 , 丁家桐 , 劉紅林 . 卵母細(xì)胞成熟的形態(tài)學(xué)特征及 其調(diào)控 [J]. 國(guó)外畜牧科技 , 2020, 26: 2630. [4] 孫興參 , 岳奎忠 , 馬所峰 . 豬卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞核成熟關(guān)系的研究 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2020, 35: 8588. [5] 張?jiān)粕?, 石國(guó)慶 . 影響哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟的因素 [期刊論文 ]貴州畜牧獸醫(yī) , 2020, 27: 6669. [6] 李俊 , 田永祥 , 曹斌云 . 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的因素 [期刊論文 ]動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī) 學(xué) , 2020, 10: 57. [7] 張曉華 , 朱增娟 , 袁水橋 . 卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中的作用 [J]. 黃牛雜志 , 2020, 23: 1012. [8] 葉華虎 , 魏泓 , 陳俊穎 . 豬卵母細(xì)胞在不同培養(yǎng)液中成熟后的發(fā)育細(xì)胞體外成熟的影響 [J]. 中國(guó)畜牧雜志 , 2020, 38: 1517. [9] 曾申明 , 朱士恩 , 余文莉 . 卵泡直徑和卵丘細(xì)胞對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受 精后發(fā)育潛力的影響 , 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào) , 2020, 44: 24. [10] 郭憲 , 陳學(xué)進(jìn) , 葉榮 . 牛卵泡卵母細(xì)胞體外成熟的研究 [J]. 中國(guó)草食動(dòng)物 , 2020, 24: 35. [11] 李榮鳳 , 薛曉先 , 劉哲 . 牛卵母細(xì)胞皮層顆粒熒光染色法成熟鑒定 [G]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) , 2020, 31: 203210. [12] 孫興參 , 岳奎忠 , 馬所峰 . 豬卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞核成熟關(guān)系的研究 [期刊論文 ]中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2020, 11: 109112. [13] 文國(guó)藝 , 黎宗強(qiáng) , 陳自洪 . 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的一些物理性因素 [期刊論文 ] 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2020, 06: 8890. 燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書(shū) 17 [14] 馬緒榮 , 蘇德模 . 藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè) [M]. 北京 : 科學(xué)出版社出 版 , 2020, 78: 229267. [15] 張莉 , 馮書(shū)堂 . 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的相關(guān)因素 [J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2020, 08: 6061. [16] 項(xiàng)智鋒 , 李艷 , 王清華 . 豬卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)研究進(jìn)展 [期刊論文 ]安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2020, 21: 7680. [17] 徐永華 . 動(dòng)物細(xì)胞工程 [M]. 北京 : 化學(xué)工業(yè)出版社 , 2020, 45: 5558. [18] 劉酷 , 李榮鳳 . 體外培養(yǎng)綿羊卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的研究 [J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 ), 2020, 3l: 101106. 。整個(gè)的課程設(shè)計(jì)其實(shí)就是一個(gè)學(xué)習(xí)的過(guò)程，一個(gè)能力提高的過(guò)程，它會(huì)激勵(lì)我們?cè)诮窈蟮膶W(xué)習(xí)中，主動(dòng)去探討和學(xué)習(xí)。 在課程設(shè)計(jì)的過(guò)程中，過(guò)的充實(shí)而 又 緊張：查閱資料、文獻(xiàn)，確定自己的設(shè)計(jì)方案，查閱相關(guān)資料和課程設(shè)計(jì)報(bào)告的撰寫(xiě)。 本次課程設(shè)計(jì)我選的題目是《卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響》，回想起這些天緊張而又充實(shí)，正如趙老師說(shuō)的，此次設(shè)計(jì)時(shí)間緊任務(wù)重。本研究結(jié)果表明，包裹卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞層的存在與其層數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟和孤雌激活后胚胎發(fā)育的能力具有重要作用。劉酷等根據(jù)卵母細(xì)胞周?chē)亚鸺?xì)胞層數(shù)對(duì)綿羊進(jìn)行分類(lèi)成熟培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)卵丘細(xì)胞包裹 3層以上和包裹 13層疏松卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞成熟率分別為82． 4％和 80． 6％，其試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)卵母細(xì)胞體外成熟結(jié)果基本一致，這在一定程度上說(shuō)明卵丘細(xì)胞層包裹程度對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟后體外成熟率并沒(méi)有顯著的影響。Antezak等和 Goud等提出卵泡液和卵丘細(xì)胞層可儲(chǔ)存和釋放某些生長(zhǎng)因子和特定蛋白，這些因子和蛋白在卵母細(xì)胞的成熟與胚胎發(fā)育過(guò)程中按一定順序或選擇性地發(fā)揮調(diào)節(jié)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的作護(hù)包裹在卵母細(xì)胞外的卵丘細(xì) 胞層，以提高卵母細(xì)胞的體外成熟及后期胚胎發(fā)育的潛力。 除卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的影響 本研究中將包裹 5層以上卵丘細(xì)胞的 COCs經(jīng)機(jī)械脫除卵丘細(xì)胞層后，其體外成熟與孤雌胚胎發(fā)育能力顯著低于正常的 COCs，這與 Geshi等試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)同。 根據(jù)包裹卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞的完整性分為 3組 :A組，有 3層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍的卵母細(xì)胞復(fù)合體記為 (COCs)； B組，有 3層卵丘細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞記為 (COCs)； C組，有 1～ 2層卵丘細(xì)胞包圍的裸露卵母細(xì)胞記為 (NOs)， 3組燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書(shū) 14 分別放于相同且適宜條件下培養(yǎng)。 卵母細(xì)胞的成熟 觀(guān)察 成熟 24 h時(shí)，將各組卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合體移入含 O． 25％透明質(zhì)酸酶的 M199(Sigma， M4530)中，移液槍輕輕吹打移除卵丘細(xì)胞，體視鏡下用玻璃針撥動(dòng)卵母細(xì)胞檢查第一極體排出的情況 (第一極體排出作為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志 )，并記錄各組成熟卵母細(xì)胞數(shù)及成熟率 。成熟培養(yǎng)條件39℃ ,5%的 CO2與飽和濕度，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 22～ 24 h。每個(gè)液滴 50μL并覆蓋石蠟油，每滴放COCs10~15枚。 C級(jí)：裸卵或卵丘細(xì)胞雖為 1～ 2層或多層，但是不完整，部分裸露 。 燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書(shū) 13 豬卵母細(xì)胞的分級(jí) 收集的未成熟豬卵母細(xì)胞以卵丘細(xì)胞層數(shù)為準(zhǔn)分 為三級(jí)： A級(jí)：卵丘細(xì)胞在 3層或 3層以上。吸卵液為 TCM199+25 mmol/L HEPES+10 μg/mL肝素+ g/L BSA。 試驗(yàn) 用的儀器 燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書(shū) 12 儀器 廠(chǎng)商 型號(hào) 體式顯微鏡 日本 Nikon SMZ 熒光顯微鏡 日本 Nikon E600 全自動(dòng)高壓消毒鍋 日本 Yamato SM51 CO2培養(yǎng)箱 美國(guó) BINDER 低溫 臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó) Eppendorf 自動(dòng)數(shù)字天平 AD EK120A 液氮罐 TaylarWharton 藥品 藥品 廠(chǎng)商 TCM199 GIBCO Hepes SIGMA FCS SIGMA FSH 寧波市激素制品有限公司 LH 寧波市激素制品有限公司 PFF 自制 青霉素 大連美羅大藥廠(chǎng) 鏈霉素 大連美羅大藥廠(chǎng) 蔗糖 上海生物優(yōu)先公司 Gly SIGMA DMSO SIGMA 細(xì)管 北京耀北生物技術(shù)公司 四孔板 北京耀北生物技術(shù)公司 卵母細(xì)胞復(fù)合體 (COCs)的收集 從屠宰場(chǎng)收集卵巢后，放入 35℃雙抗 生理鹽水中，用保溫瓶在 3 h 內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室 ， 去除血污。 卵巢 豬 卵巢 采集自河北省秦皇島市海濱區(qū)新店子屠宰場(chǎng) 。本研究主要目的有兩點(diǎn)：第一，深入探討卵丘細(xì)胞支持卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的作用機(jī)制；第二，通過(guò)改善體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)，最大限度的提高裸卵的體外成熟及發(fā)育能力，為生發(fā)泡移植和 GV期卵母細(xì)胞冷凍保存等技術(shù)提供有效的裸卵成熟方法。所以，繼續(xù)深入認(rèn)識(shí)卵母細(xì)胞的成熟規(guī)律、改善體外成 熟培養(yǎng)環(huán)境、建立一種完善的卵母細(xì)胞體外成熟系統(tǒng)是當(dāng)前胚胎工程研究的重要內(nèi)容之一。目前認(rèn)為，這可能是由于體外成熟的卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟不充分造成的。 燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書(shū) 11 第二部分 課程設(shè)計(jì)部分 卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響 獲取高質(zhì)量的體外成熟卵母細(xì)胞是成功進(jìn)行人類(lèi)體外受精、動(dòng)物胚胎生產(chǎn)和克隆的關(guān)鍵。 (2) 去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中線(xiàn)粒體由簇狀分布逐漸變?yōu)樯⒉加诼奄|(zhì)內(nèi)，該過(guò)程與卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟過(guò)程中線(xiàn)粒體變化規(guī)律相符。利用透 射電子顯微鏡技術(shù)觀(guān)察去卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的超微結(jié)構(gòu)變化，目的是在亞細(xì)胞水平上尋找由于卵丘細(xì)胞的去除而導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量降低的原因。對(duì)于卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞聯(lián)系的內(nèi)在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。體外成熟培養(yǎng)時(shí)，需選擇從直徑大于 2mm卵泡內(nèi)吸出的卵丘細(xì)胞致密的多卵丘細(xì)胞卵進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果還表明，卵泡直徑與卵丘細(xì)胞多少具有相關(guān)性，卵泡越大，多卵丘細(xì)胞卵所占的比率越高 ［ 11］ ?？梢?jiàn)，裸卵是一類(lèi)尚未成熟即趨于退化的卵子，不能正常受精及進(jìn)一步發(fā)育。 李榮鳳等實(shí)驗(yàn)，以皮層顆粒（ CG）單層分布于質(zhì)膜下做為卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的指標(biāo)，分別于成熟培養(yǎng)前后觀(guān)察各類(lèi)卵子的 CG分布情況。這些結(jié)果與 Abdoon的報(bào)道一致，他也發(fā)現(xiàn)大部分的卵母細(xì)胞有 5層或更多層的卵丘細(xì)胞，并且具有均勻致密的卵質(zhì)。目前的研究中，回收的大部分卵母細(xì)胞都有完整的卵丘細(xì)