轉染技術原理及應用(參考版)
2025-07-17 22:42本頁面
【正文】 Biolistic 顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內逐步釋放，表達瞬時性轉染 可用于：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞 顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核 穩(wěn)定轉染，瞬時性轉染 轉染細胞數有限，多用于工程改造或轉基因動物的胚胎細胞第 7 頁 共 7 頁。一些傳統(tǒng)的轉染技術，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質體法各有利弊，其主要原理及應用特點見下：轉染方法 原理 應用 特點 DEAE右旋糖苷法帶正電的DEAE右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞 瞬時性轉染 相對簡便、結果可重復但對細胞有一定的毒副作用，轉染時需除血清磷酸鈣法磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞 穩(wěn)定轉染，瞬時性轉染 不適用于原代細胞，操作簡便但重復性差，有些細胞不適用。此外，對一些內毒素敏感的細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞），QIAGEN還提供可去除內毒素污染的質粒抽提試劑盒，在質粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉染效果。一般的轉染技術（如脂質體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。如果基因產物對細胞有毒性作用，轉染也很難進行，因此選擇組成或可調控，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉染正對照可排除毒性影響的干擾。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。但有些對此敏感的細胞如原代細胞會受到損傷，甚至死亡導致轉染效率極低。因此在轉染前建議先測(轉右)試出對細胞生長良好的血清批號，轉染時用同一批號的血清，并同時做負對照（不加轉染試劑及外源DNA）以測試細胞生長是否正常。通常的，血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。2. 血清大多數培養(yǎng)基在使用前需要加血清。推薦在轉染前24小時分細胞，這將提供正常細胞代謝，增加對外源DNA攝入的可能。低的細胞代數（50）能確?；蛐筒蛔?。轉染效率收多種因素影響，主要因素有下面幾個：1. 細胞培養(yǎng)物健康的細胞培養(yǎng)物是成功轉染的基礎。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。一般來說，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后2496小時內（依賴于各種不同的構建）分析結果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。常規(guī)轉染技術可分為兩大類，一類是瞬時轉染，一類是穩(wěn)定轉染（永久轉染）。隨著功能研究的興起，其應用越來越廣泛。如果基因產物對細胞有毒性作用，轉染也很難進行，因此選擇組成或可調控，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉染正對照可排除毒性影響的干擾。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。當使用GenEscort轉染試劑時，即使采用傳統(tǒng)的酚－氯仿沉淀方法純化質粒，仍然可達到非常好的轉染效果，但所用的質粒量比試劑盒純化方法的DNA用量大一些。此外，對一些內毒素敏感的細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞），QIAGEN
范文總結相關推薦
鄂ICP備17016276號-1