【正文】 二甲苯及苯類物質(zhì)被認(rèn)為是一種致癌性的物質(zhì)，許多單位和個(gè)人都不敢用或盡量少用，或者在切片染色至酒精后，將切吹干就進(jìn)行封片，這種做法是非常糟糕的，以。如果將沒脫水好的組織繼續(xù)做下去，切片將不完整。如果組織在二甲苯放置到一定時(shí)間后，仍沒有達(dá)到透明，組織塊中間可出現(xiàn)粉白色的現(xiàn)象，這說明組織沒有完全脫水，處理這種情況有兩種方法，一是將其重新放入酒精 25 脫水，然后再透明，這種方法處理的組織很硬，切片較難?？傊M織的透明，應(yīng)視組織的大小而定，不能千篇一律，要經(jīng)常觀察組織的透明情況，組織一經(jīng)透明，就必須從二甲苯中取出。 二甲苯是一種透明無色的液體，揮發(fā)性強(qiáng)，打開后即可聞其味道，能溶解石蠟，能溶于酒精及丙酮等，但不能溶于水，它是一種良好的透明劑，組織經(jīng)充分脫水后放入該試劑，視組織的大小、種類的不同，確定不同的時(shí)間，便能達(dá)到透明目的。它們是二甲苯、苯、三氯甲烷（氯仿）、香柏油、苯酚、松節(jié)油和汽油等。 如為揭蓋式的脫水機(jī)，液體容易揮發(fā)，污染環(huán)境，影響工作條件。 能大批量地處理標(biāo)本。 整個(gè)過程過置于真空負(fù)壓的條件下來進(jìn)行，尤其是浸蠟，可節(jié)省 1/3 以上的時(shí)間，浸蠟充分徹底，尤其是對(duì)多孔的組織如肺組織，效果更明顯。這樣一是保證了試劑不揮發(fā)，尤其是夏天，室溫較高，試劑揮發(fā)快，如為揭蓋式的脫水機(jī)，試劑揮發(fā)的程度無法形容，幾乎每天都必須添加，這樣試劑用量大，二是對(duì)環(huán)境污染不明顯，保證了舒適的工作環(huán)境。 根據(jù)我們對(duì)各種不同的脫水機(jī)的應(yīng)用比較，認(rèn)為這種脫水機(jī)有以下特點(diǎn)： 該機(jī)容量大，每次可處理組織塊 250300 塊，這對(duì)于大、中等醫(yī)院的病理科較合適。試劑貯存箱內(nèi)由 12 個(gè)缸組成，每個(gè)缸的容量為 升。第五套為“八一”程序，第六套為“十一”程序，第七套為元旦程序，第八套為春節(jié)程序，這后 面幾套為節(jié)假日程序，根據(jù)節(jié)假日的放假時(shí)間不同，編排不同的程序。根據(jù)需要，該機(jī)可編九套程序輸入電腦，我們的編程如下：第一套為正常室溫下脫水程序，該程序在換新試劑的幾天內(nèi)使用。 這種脫水機(jī)由電腦、反應(yīng)缸和試劑貯存缸三個(gè)部分組成，這三 部分可以分開使用，也可以結(jié)合在一起，形成一個(gè)柜式，一臺(tái)電腦可控制 5 臺(tái)脫水機(jī)。國(guó)外生產(chǎn)的也有同類產(chǎn)品。這種機(jī)器脫水時(shí)也屬于揭蓋式的，因此，試劑容易揮發(fā)，特別在夏天，必須經(jīng)常添加試劑，以補(bǔ)充被揮發(fā)去的試劑。 圓盤式自動(dòng)組織脫水機(jī)。這種機(jī)子容量小，脫水用的試劑不足一升毫升，組織塊脫水用的提籃小，每次只能容納 40 塊組織左右，它適合于較 小的單位，但不適合于大單位。 （ 2）、自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水法 自動(dòng)組織脫水機(jī)的機(jī)型品種繁多，大小不一，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的軌道式和圓盤式兩種，國(guó)外生產(chǎn)的有圓盤式和柜式兩種，上述國(guó)內(nèi)外四種型號(hào)的機(jī)子，我們都使用過，根據(jù)使用的效果做一簡(jiǎn)單介紹。 不能大批量的進(jìn)行脫水。 可以多層次地進(jìn)行脫水。 組織脫水，目前常用的有兩種方法 人工組織脫水法 該法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，靈活度高，可根據(jù)不同的組織及其大小來確定脫水時(shí)間，也可根據(jù)不同組織及大小分批進(jìn)行脫水，其優(yōu)點(diǎn)是： 可根據(jù)不同的組織及大小，任意增減脫水時(shí)間，達(dá)到脫水目的。在使用時(shí)， 通常是從低濃度至高濃度，濃度系列通常是 70%、 80%、 90%、 95%和 100%，組織經(jīng)過這一系列處理后，基本可達(dá)到脫水的目的。因它不管在什么樣比例的情況下都能和水混合，所以它可以慢慢地將水從組織中置換出來。據(jù)測(cè)定，人體的物質(zhì)組成約含水 55~67%，蛋白質(zhì) 15~18%，脂類 10~15%，無機(jī)鹽 3~4%及糖類 1~2%[14]。 23 （一） 組織脫水 把含于組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的水份用脫水劑把 其置換出來的過程稱組織脫水。 第四節(jié) 病理制片程序 一常規(guī)石蠟切片制片法 組織經(jīng)系列酒精的脫水，經(jīng)透明劑的作用，經(jīng)熔化的石蠟的浸漬，包埋后所切成的切片稱為石蠟切片。因?yàn)榛顧z取材，現(xiàn)目前組織的制作，都基本上用機(jī)器來進(jìn)行，而所用的脫水盒，有銅和不銹剛的金屬物所制成，組織取材后，一個(gè)一個(gè)的盒子裝著組織，如果除去金屬來用微波固定，這是不現(xiàn)實(shí)的事情。 一提固定，以往總與福爾馬林分不開，而經(jīng)微波輻射后的固定效果，竟然比前者好，這就解決了一大難題，即快速石蠟切片及冰凍切片的組織固定，以往用加熱固定的方法，其結(jié)果導(dǎo)致福爾馬林蒸發(fā)，使整個(gè)房間都充滿福爾馬林氣味，既污染了環(huán)境，也影響了身體的健康。例如多少 ml 的固定液需要多少時(shí)間達(dá)到多少溫度，用的是哪一檔次的火等。微波爐一般分為高火、中火及低火。我們的實(shí)驗(yàn)認(rèn)為， 65℃左右的溫度可適合于各種組織，條件是固定取小塊材料，時(shí)間在截取 34min。 究竟微波產(chǎn)生的熱量需要多高，才級(jí)使蛋白凝固的呢： Masson 氏等人的研究表明，70090℃，對(duì)沒有固定的蛋白可發(fā)生變性。按實(shí)際的應(yīng)稱為微波輻射凝固蛋白。 微波是一種具有能量的電磁波，在其運(yùn)動(dòng)期間可產(chǎn)生瞬間熱。但是這些固定劑從某些方面來說其穿透力不很強(qiáng)，因而需要較長(zhǎng)時(shí)間的固定，另者，臨床上的冰凍切片，有的應(yīng)用快速加熱法預(yù)先固定組織，造成福爾馬林的極度揮發(fā)，污 染環(huán)境，影響人們的身體健康，因此尋找其它固定組織的方法就成為研究的重點(diǎn)。 [8]－ [9] 組織固定的結(jié)果是組織中的蛋白質(zhì)凝固，以保存組織中原有的微細(xì)結(jié)構(gòu)。 具有毒性。經(jīng)升汞配成的混合固定液固定的組織，一是不能固定太長(zhǎng)時(shí)間，經(jīng) 24h 后沖 水，然后保存于 70%或 80%的酒精中，二是在洗色前，都必須用碘除去汞鹽的沉淀，以免由于汞鹽沉淀在切片上而影響對(duì)切片的觀察。 可配成許多混合固定液如： Zenker 氏、 Helly 氏和 Stieve 氏等。應(yīng)用升汞配成的固定液的優(yōu)點(diǎn)有： 細(xì)胞核及細(xì)胞漿染色清晰。它可使組織蛋白凝固，迅速硬化而形成白色硬膜，這是由于它穿透力極弱所致，因此它不適合固定較厚的組織。 （六） 氯化汞又稱升汞，具有毒性。在配制液體時(shí)，如清洗劑，當(dāng)加入硫酸時(shí)，可產(chǎn)生很高的溫度，并揮發(fā)出刺鼻的氣體，應(yīng)特別注意。 重鉻酸鉀的不足之處有： 不能沉淀蛋白質(zhì)，它必須和醋酸配成混合固定液，方能發(fā)揮作用，產(chǎn)生鉻酸，沉淀蛋白質(zhì)。 此液原配方要求加入硫酸鈉，但據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，硫酸鈉在液中對(duì)組織無任何作用，故省去。 可配成多種的混合固定液 （ 1） Helly 氏液 [7] 重鉻酸鉀 25g 升汞 50g 蒸餾水 1000ml 甲醛 50ml 臨用時(shí)加入甲醛，因其加入后于 24 小時(shí)后可發(fā)生沉淀而失效，因用時(shí)應(yīng)特別注意。它的優(yōu)點(diǎn)是： 能固定脂肪及類 脂物。 價(jià)格較貴。另外，在蘇木素和伊紅染液中，也常加入了冰醋酸。冰醋酸也有許多不足之處： 不能作為單一的固定劑。如果做 HE 的染色，該液不適合。應(yīng)用該固定液的組織，細(xì)胞核及細(xì)胞漿染色十分清晰，特別是要顯示骨骼肌的橫紋時(shí)，應(yīng)用本液可獲得滿意的結(jié)果，但由于其含有醋酸，故不能用于保存細(xì)胞顆粒，紅細(xì)胞及含鐵血黃素。臨用時(shí)，取貯存液 950ml，加入 50ml 的冰醋酸，即可使用。根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)，用它配成許多種不 同的混合固定液，以達(dá)到固定好，收縮少，易切片，效果好等目的。 各種固定液對(duì)組織都有收縮的作用，尤其是對(duì)富含纖維的組織。冰醋酸為無色透明的液體，易揮發(fā)，氣味大 ，一打開瓶蓋，整個(gè)文章都可聞其味道，純醋酸在 17℃時(shí)常為結(jié)晶狀，因稱為冰醋酸，在冬天使用時(shí)，可用微波爐進(jìn)行解凍，再行使用，它的優(yōu)點(diǎn)有： 能迅速固定染色質(zhì)，助于染色，用醋酸配成的固定液，其作用快，固定效果均勻，對(duì)于染色質(zhì)的固定快，因此，用其作固定的切片染色好，在配其它染色液如明礬蘇木素和伊紅時(shí)，常常需加入一定量的醋酸，以促進(jìn)染色。從經(jīng)濟(jì)學(xué)的角度，應(yīng)用酒精固定組織劃不來，例如：一瓶 500ml的甲醛，可配成 500ml 的固定液，按每例標(biāo)本需要 100ml 計(jì)，可固定 50例標(biāo)本，而一瓶 500ml 的酒精，即使配成 80% 酒精，也只能固定 6 例標(biāo)本，因此，若用酒精固定組織，其價(jià)格比用甲醛固定組織的要高 8 倍。切片脫水時(shí)，要較快地通過低濃度的酒精，以免使已著染的顏色被脫去。 可脫去切片上已著染的各種顏色，切片經(jīng)染色后，一是必須洗去多余的染液，二是必須脫去切片上的水。當(dāng)用酒精固定組織時(shí)，組織表面很快就被固定，并形成了 20 一層蛋白膜，這層膜可阻擋固定液向里滲透，造成了中間組織固定不佳的現(xiàn)象。因此，它不作為單純的固定液。 對(duì)組織收縮較大，不宜作單純固定液。應(yīng)用時(shí)應(yīng)多加注意。溶液中的氯仿和酒精，對(duì)組織的收縮較厲害，但應(yīng)用了冰醋酸，這種現(xiàn)象便被中和去。 可與其它試劑配成多種的混合固定液，有時(shí)為了加快固定，常采用酒精和其它試劑來配成混合固定液，這種固定液在固定的同時(shí)，兼有對(duì)組織脫水的作用。然后移入 75%的酒精中。 可用來保存標(biāo)本。 能除去切片上的水份，使切片無水化。 可溶解苯類物質(zhì)為染色步驟中的橋梁試劑。如果沒有酒精，將會(huì)無法完成必要的工作。高濃度的酒精如 95%，無水酒精可保存上述兩種物質(zhì)，因它們易溶于水，因此，要證明上述兩種物質(zhì)的存在， 19 就不能用含水的固定液來固定組織。 （ 2）酒精：又稱乙醇，為無色透明的液體，沸點(diǎn)是 78 度，工業(yè)酒精是 95%。但美中不足的是：經(jīng)它固定的組織，可與蛋白形成醛交聯(lián)蛋白，這種醛鍵可封閉抗原。 當(dāng)前國(guó)內(nèi)外基本上都還是要用甲醛來固定組織。 5．醛糖鈣固定液 甲醛 100ml 蔗糖 300ml 乙酸鈣 20g 蒸鎦水 90ml 先將蔗糖和乙酸鈣溶于蒸鎦水，后加入甲醛。兩種試劑的混合使用，用以抵消彼此間的副作用。 Bouin 氏固定液 苦味酸飽和水溶液 75 ml 甲醛 2 ml 冰醋酸 5 ml 該固定液中的冰醋酸，對(duì)膠原纖維等組織有膨脹作用。 10%福爾馬林鹽固定液 甲醛 100 ml 自來水 900ml Nacl9 克 先將 Nacl 溶于水，再加入甲醛。 甲醛可配成簡(jiǎn)單的或混合的固定液，最簡(jiǎn)單和最容易掌握的方法，就是取 10ml 甲醛液，加水 90ml，這就是 10%的福爾馬林 .當(dāng)然 ,現(xiàn)在使用的固定液要求較為嚴(yán)格些 ,最好是使用緩沖福爾馬林固定液 ,這將有利于后來的免疫組化染色的需要 . 從組織學(xué)的觀點(diǎn)來說 ,甲醛是一種良好的固定劑 ,它有很多的優(yōu)點(diǎn) : 1. 組織收縮較少 ,損傷少 ,保存固有物質(zhì)好 . 2. 固定均勻 ,穿透力強(qiáng) . 3. 能使組織硬化 ,增進(jìn)組織彈性 ,有利于切片 . 4. 能保存脂肪及脂類物質(zhì) . 5. 成本較低 . 雖然甲醛有上述的優(yōu)點(diǎn) ,但這都是相對(duì)而言 ,任何物質(zhì)都不可能十全十美的 ,它也有許多缺點(diǎn) : 1. 雜質(zhì)含量較多 ,如甲醇 ,可鈍化酶類 ,影響反應(yīng) . 2. 含有微量甲酸 ,導(dǎo)致固定液酸變 ,影響染色 . 3. 可產(chǎn)生福爾馬林色素 ,影響觀察 . 4. 不能固定尿酸和糖類物質(zhì) . 5. 容易揮發(fā) ,污染環(huán)境 ,可導(dǎo)致標(biāo)本干涸 . 6. 可長(zhǎng)期存在于固定過的組織上 .有人做過實(shí)驗(yàn) ,組織用甲醛固定后在 流水中沖洗 5 小時(shí)后 ,仍留有相當(dāng)多的甲醛與蛋白質(zhì)相結(jié)合 ,但需要經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的流水沖洗 (24 天的沖洗 )方能除去 .可見存在于組織上的甲醛是不可能除去的 .因?yàn)榕R床活檢不可能有這么長(zhǎng)的時(shí)間來沖洗組織 .因此要特別指出的是 ,在其后的各種技術(shù)操作中 ,要特別注意到甲醛的存在 ,必須要想辦法除去它 ,否則將會(huì)給各種染色造成影響 ,甚至導(dǎo)致 18 失敗 . 應(yīng)用甲醛 ,可以配成許多種固定液 : 1. 10%緩沖福爾馬林固定液 甲醛 100ml 蒸餾水 900ml NaH2PO4甲醛與組織蛋白類的反應(yīng)是多樣和復(fù)雜的，因?yàn)樗芎投喾N不同的功能基團(tuán)結(jié)合，在多數(shù)情況下在其間形成橋鍵。 甲醛有效固定作用的要點(diǎn)是，在蛋白質(zhì)末端基團(tuán)之間形成交聯(lián)鏈。 甲醛溶液較難純化，在每批市售商品中，都含有不少的雜質(zhì)如甲醇，這種在組織化學(xué)方法當(dāng)中，能使酶鈍化，影響其反應(yīng)。 （十）甲醛 甲醛商品名為福爾馬林，一般市售的含甲醛 37— 40%，由甲醛氣體飽和于水而成，比重為 。 [5] 上述四種類型的固定劑，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技術(shù)方面中用到。 Ⅲ類：蛋白變性類，甲醇，乙醇，醋酸等。根據(jù) Bencroft 的分類法，將不同的固定劑分為四種類型： Ⅰ類：醛類，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。其使用方法是先用戊二醛固定，再用奧 17 酸固定。否則，效果不佳。這種方法稱為二次固定或后固定。在一般的常規(guī)病理活檢組織 中，往往用一種固定液，就能夠達(dá)到目的，獲得滿意的結(jié)果。固定劑是一種化學(xué)語(yǔ)試劑，有液體和固體及之分，平常使用的多為液體，Pearse 指出，對(duì)每個(gè)既定的組織化學(xué)方法來說，選用最合適的固定方法是極為重要的；在組織化學(xué)研究中的準(zhǔn)備階段，不論采用什么固定劑，都必須盡可能確切地知道它們對(duì)于各種組織成分反應(yīng)基團(tuán)的效用。一般的病例標(biāo)本，如沒特殊的要求，都可以應(yīng)用甲醛配成的各種固定液來固定。對(duì)于大的標(biāo)本，原則上是不讓其暴露部分被吹干，這是因?yàn)樵诂F(xiàn)實(shí) 111 當(dāng)中，大的標(biāo)本往往露出容器一大半，因此對(duì)于這種情況，應(yīng)取些脫脂棉或紗布，浸濕固定液后，蓋于組織表面，以免使組織被風(fēng)干，影響制片效果。固定液量的足夠與否決定著組織