【正文】 ② Sephadex LH20：為 Sephadex G25經(jīng)羥丙基化后得到的產(chǎn)物，具有以下兩個(gè)特點(diǎn)：具有分子篩特性，可按分子量大。 （ 2）出柱順序：按分子由大到小順序先后流出并得到分離。 第二章總結(jié) 168 （四）根據(jù)物質(zhì)分子大小進(jìn)行分離 1．凝膠過濾法： （ 1）原理：分子篩原理。 （ 4）洗脫液的選擇：洗脫液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。 （ 3）應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于化合物的分離與富集工作中。糖是極性水溶性化合物，與 D型非極性樹脂吸附作用很弱。分子篩是由于其本身多孔性結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的。 （ 1）原理： 吸附性和分子篩 性相結(jié)合。 ②脫鞣質(zhì)處理 ③ 對(duì)生物堿、萜類、甾類、糖類、氨基酸等其他極性與非極性化合物的分離也有著廣泛的用途。 ③分子中芳香化程度高，則吸附性增強(qiáng)；反之，則減弱。 ②成鍵位置對(duì)吸附能力也有影響。吸附強(qiáng)弱取決于各種化合物與之形成氫鍵締合的能力。 第二章總結(jié) 164 5．聚酰胺吸附色譜法： （ 1）原理：氫鍵吸附。 （ 3）為避免化學(xué)吸附，酸性物質(zhì)宜用硅膠、堿性物質(zhì)宜用氧化鋁作為吸附劑進(jìn)行分離。 （ 2）一般以 TLC展開時(shí)使組分 Rf值達(dá)到 ~為最佳溶劑系統(tǒng)進(jìn)行洗脫。介電常數(shù)越大，則極性越大。從活性炭上洗脫被吸附的物質(zhì)時(shí)，溶劑的極性越小，洗脫能力越強(qiáng)。 常用的非極性吸附劑：活性炭。隨溶劑極性的增強(qiáng)，則吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附力將減弱。強(qiáng)極性溶質(zhì)將優(yōu)先被吸附。硅膠顯微酸性，適于分離酸性和中性化合物，分離生物堿時(shí)需在流動(dòng)相中加入適量的有機(jī)堿；氧化鋁呈堿性，適于分離生物堿等堿性成分，不宜用于分離有機(jī)酸、酚性等酸性成分。 （ 2）被分離的物質(zhì)與吸附劑、洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析的三要素，彼此緊密相連。 第二章總結(jié) 157 （三）根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 其中以固 — 液吸附用的最多，并有物理吸附（硅膠、氧化鋁、活性炭為吸附劑進(jìn)行的吸附色譜）、化學(xué)吸附（黃酮等酚酸性物質(zhì)被氧化鋁吸附、生物堿被酸性硅膠吸附等）及半化學(xué)吸附（聚酰胺與黃酮類、醌類等酚性化合物之間的氫鍵吸附，吸附力較弱，介于物理吸附與化學(xué)吸附之間）之分。 應(yīng)用：用作微量分析，特別適合于親水性較強(qiáng)的成分，其層析效果往往比吸附薄層色譜效果好。 第二章總結(jié) 156 2．紙色譜（ PPC）：紙色譜的原理與液 — 液萃取法基本相同。 ④液滴逆流分配法（ DCCC）：本法必須選用能生成液滴的溶劑系統(tǒng)，且對(duì)高分子化合物的分離效果較差，處理樣品量小，并要有一定的設(shè)備，操作較繁瑣。其裝置可具有一根、數(shù)根或更多根的萃取管。 第二章總結(jié) 155 （ 2）各種萃取方法： ① 簡單萃?。豪梅忠郝┒愤M(jìn)行兩相溶劑萃取。 1．兩相溶劑萃取法 （ 1）原理：利用混合物中各成分在兩相互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)分離。如加入鉛鹽、雷氏銨鹽等。 如：酸提堿沉法，堿提酸沉法等。如：水 — 醇法除多糖、蛋白質(zhì)等水溶性雜質(zhì)；醇 — 水法除樹脂、葉綠素等水不溶性雜質(zhì)；醇 — 醚法或醇 — 丙酮法使苷類成分，而脂溶性樹脂等雜質(zhì)則存留在母液中。 色譜法：單一化合物在薄層色譜或紙色譜層析中經(jīng)三種不同的溶劑系統(tǒng)展開，均為一個(gè)斑點(diǎn)者。 熔點(diǎn)和熔距：單一化合物具有一定的熔點(diǎn)和較小的熔距，結(jié)晶前后的熔點(diǎn)應(yīng)一致，熔距很窄，在1℃ ?2℃ 的范圍內(nèi)。 （ 2）結(jié)晶操作： 結(jié)晶操作實(shí)際是進(jìn)一步分離純化過程，一般是應(yīng)用適量的溶劑在加熱至沸點(diǎn)的情況下將化合物溶解，制成過飽和溶液，趁熱過濾去除不溶性雜質(zhì)，放置冷處，以析晶。若無理想的單一溶劑時(shí)，可以考慮使用混合溶劑。將不是結(jié)晶狀態(tài)的固體物質(zhì)處理成結(jié)晶狀態(tài)的操作稱結(jié)晶；將不純的結(jié)晶進(jìn)一步精制成較純的結(jié)晶的過程稱重結(jié)晶。如樟腦、咖啡因。 （ 3）升華法：固體物質(zhì)受熱不經(jīng)過熔融，直接變成蒸汽，遇冷后又凝固為固體化合物，稱為升華。 （ 2）各種溶劑提取法 溶劑提取法一般包括浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、連續(xù)回流提取法等，其使用范圍及特點(diǎn)見下表。其中，溶劑提取法應(yīng)用最廣。測定技術(shù)也有各種去偶方法，最常用的是質(zhì)子寬帶去偶， 13C信號(hào)在圖譜上為單峰。 （ 2） 13CNMR: 提供碳原子的情況。 化學(xué)位移 (δ)：因氫核周圍化學(xué)環(huán)境不同，其外圍電子云密度及繞核旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的磁屏蔽效應(yīng)不同，則不同的氫出現(xiàn)在不同區(qū)域。給出氫的數(shù)目、種類、相鄰基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。 可根據(jù)紫外吸收光譜的位置及吸收峰的數(shù)目，可初步推測化合物的不飽和部分結(jié)構(gòu)。 139 （三） 紅外光譜 （ IR) 特征官能團(tuán) 化合物用量只需 5~10微克，測定范圍500~4000cm1, 有兩個(gè)區(qū)，一個(gè)是指紋區(qū)在 1000cm1以下，每個(gè)化合物有自己的特征指紋圖譜；另一個(gè)是特殊功能區(qū)，在 1000~ 4000cm1 ，可以確定羰基、苯環(huán)、羥基等功能基。分析碎片離子，推斷結(jié)構(gòu)信息。 137 中藥化學(xué)成分結(jié)構(gòu)測定的一般程序和方法 三、 結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法 （一）確定分子式并計(jì)算不飽和度 分子式的測定可用元素定量分析配合分子量測定、同位素峰度比法和高分辯質(zhì)譜（ HR－ MS）法 138 中藥化學(xué)成分結(jié)構(gòu)測定的一般程序和方法 （二）質(zhì)譜（ MS） 測定有機(jī)分子的分子量。 結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研 136 中藥化學(xué)成分結(jié)構(gòu)測定的一般程序和方法 程序： 結(jié)構(gòu) 方法： （ 1）綜合分析譜學(xué)數(shù)據(jù)及官能團(tuán)定性、定量分析結(jié)果。 分子式測定方法： （ 1）元素定量分析配合分子量測定。 ，如不同的 pH、不同溶劑中的溶解度及色譜行為、灼燒試驗(yàn)、化學(xué)定性反應(yīng)等。 132 中藥化學(xué)成分結(jié)構(gòu)測定的一般程序和方法 二、結(jié)構(gòu)研究的主要程序 初步推斷化合物類型 —— 測定分子式，計(jì)算不飽和度 —— 確定分子中含有的官能團(tuán)，或結(jié)構(gòu)片斷，或基本骨架 —— 推斷并確定分子的平面結(jié)構(gòu) —— 推斷并確定分子的立體結(jié)構(gòu)（構(gòu)型、構(gòu)象）。 HPLC檢測為一個(gè)單峰。 具固定的熔點(diǎn)，熔距在 1～ 2℃ 以內(nèi)。 物理常數(shù)：熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、比旋度、折光率等； 131 中藥化學(xué)成分結(jié)構(gòu)測定的一般程序和方法 化學(xué)成分純度的判斷 三種以上的展開系統(tǒng)展開， TLC上均為單一斑點(diǎn)。一般，只有當(dāng)樣品在三種展開系統(tǒng)中呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)時(shí)方可確認(rèn)其為單一化合物。 離子交換色譜 128 分離法（小結(jié)） （一）根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離 （二）根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離 （三）根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 （四）根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 （五）根據(jù)物質(zhì)解離程度不同進(jìn)行分離 （六）根據(jù)物質(zhì)的沸點(diǎn)進(jìn)行分離 129 中藥化學(xué)成分結(jié)構(gòu)測定的一般程序和方法 中藥材 → 提取 → 分離 → 有效成分 → 鑒定 →化學(xué)結(jié)構(gòu) → 生物活性 130 中藥化學(xué)成分結(jié)構(gòu)測定的一般程序和方法 一、化合物的純度測定 如檢查有無均勻一致的晶形，有無明確、敏銳的熔點(diǎn)。 應(yīng)用 主要用于生物堿、有機(jī)酸及氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等水溶性成分的分離純化。 吸附色譜 126 凝膠過濾色譜 （凝膠滲透色譜、分子篩濾過、排阻色譜） 原理：分子篩作用 葡聚糖凝膠（ sephadex G） 羥丙基 葡聚糖凝膠 (sephadex LH20) 127 基本原理 基于混合物中各成分解離度的不同而分離。 （ 2）原理 既有 吸附性 ，又有 分子篩 的篩選性。理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑。 吸附色譜 125 大孔吸附樹脂法 性能及分離原理 （ 1） 性能： 大孔樹脂是一種不含交換基團(tuán)，具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。對(duì)于非極性吸附劑，則相反。 4）對(duì)聚酰胺柱的洗脫能力，與溶劑的種類有關(guān)：甲酰胺，丙酮，甲、乙醇，水依次減弱。 2）形成分子內(nèi)氫鍵的物質(zhì)吸附能力會(huì)減弱。聚酰胺的吸附容量大。 * 聚酰胺 適于分離黃酮、酚、醌類、有機(jī)酸及鞣質(zhì)，可使性質(zhì)極相近的化合物得到分離。 流動(dòng)相：正相色譜中主要用有機(jī)溶劑；反相色譜中常用甲醇 水或乙腈 水系統(tǒng)。 反相色譜：固定相極性 流動(dòng)相極性，用于分離非極性和中等極性的成分 分配色譜 分配色譜 120 洗脫規(guī)律： 正相色譜中，極性小的化合物先被洗脫（固定向極性大），極性大的化合物后被洗脫；反相色譜正好相反。 117 吸附色譜 凝膠過濾色譜 離子交換色譜 大孔樹脂色譜 分配色譜 色譜分離法 色譜分離法小結(jié) 118 原理： 利用被分離成分在固定項(xiàng)和流動(dòng)項(xiàng)之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離。 115 （六）根據(jù)物質(zhì)的沸點(diǎn)進(jìn)行分離 分餾法是利用中藥中各成分沸點(diǎn)的判別進(jìn)行提取分離的方法，主要適用于液體混合物的分離，如揮發(fā)油和一些液體生物堿的提取分離。而流動(dòng)相除了傳統(tǒng)應(yīng)用的磷酸鹽緩沖液外，近來還采用由揮發(fā)性有機(jī)酸 (甲酸、醋酸 )、堿 (如吡啶、 2甲基吡啶、三甲基吡啶、 N乙基嗎啉 )做成的緩沖液，以利在以后采用減壓濃縮或冷凍干燥法除去。離子交換色譜的原理與上相同，但工作要細(xì)致得多，關(guān)鍵在于選好固定相 (樹脂 )及流動(dòng)相 (洗脫用緩沖液 )。例如將三者混合物的水溶液通過 NHf型弱酸性樹脂，隨后先用水洗下 (I)，繼續(xù)用 NH4Cl洗下 (Ⅱ )，最后用 Na2C03洗下 (Ⅲ )。 111 (五 )根據(jù)物質(zhì)離解程度不同進(jìn)行分離 3．離子交換法應(yīng)用 (1)用于不同電荷離子的分離：天然藥物水提取物中的酸性、堿性及兩性化合物可按下列圖式進(jìn)行有效的分離，這在分離、追蹤有效部位時(shí)很有用處。此外，并可能有一 N+(CH3)3 Cl， C00H及 NHNH、 N等基團(tuán)，根據(jù)交換基的不同，離子交換樹脂分為： 陽離子交換樹脂 強(qiáng)酸性 (一 SO3H+) 弱酸性 (一 C00H+) 陰離子交換樹脂 強(qiáng)堿性 (N+(CH3)3 Cl) 弱堿性 (一 NH2， NH， — N) 110 (五 )根據(jù)物質(zhì)離解程度不同進(jìn)行分離 離子交換樹脂的交換能力取決于離子交換基團(tuán)的數(shù)量。不同交聯(lián)度適于分離不同大小的分子。其基本結(jié)構(gòu)以強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂為例，如圖示： 107 (五 )根據(jù)物質(zhì)離解程度不同進(jìn)行分離 (1)母核部分，為由苯乙烯通過二乙烯苯(DVB)交聯(lián)而成的大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔大小用交聯(lián)度 (即加入交聯(lián)劑的百分比 )表示。當(dāng)流動(dòng)相流過交換柱時(shí)，溶液中的中性分子及不與離子交換樹脂交換基團(tuán)發(fā)生交換的化合物將通過柱子從柱底流出，而具有可交換的離子則與樹脂上的交換基團(tuán)進(jìn)行離子交換并被吸附到柱上，隨后改變條件，并用適當(dāng)溶劑從柱上洗脫下來，即可實(shí)現(xiàn)物質(zhì)分離。以下僅簡單介紹離子交換法。二乙氨乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠 (DEAE— sephadex)、磺丙基交聯(lián)葡聚糖凝膠 (SPsephadex)及苯胺乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠 (QAE— sephadex)等，分別具有不同的特色及應(yīng)用范圍，有關(guān)專著中均有記載，可以參閱利用。如長期不用時(shí)，可在以上處理基礎(chǔ)上，減壓抽干，再用少量乙醚洗凈抽干，室溫充分揮散至無醚味后， 60～ 80℃ 干燥后保存。暫時(shí)不用時(shí)可以水洗。Sephadex LH20價(jià)格比較昂貴。 101 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 sephadex LH20對(duì)各種溶劑的保留量 102 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 sephadex LH20除保留有 sephadex G25原有的分子篩特性，可按分子量大小分離物質(zhì)外，在由極性與非極性溶劑組成的混合溶劑中常常起到反相分配色譜的效果，適用于不同類型有機(jī)物的分離，在天然藥物分離中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。因此與 sephadex G不同，不僅可在水中應(yīng)用，也可在極性有機(jī)溶劑或它們與水組成的混合溶劑中膨潤使用。 97 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 交聯(lián)葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu) Sephadex G型只適于在水中應(yīng)用，且不同規(guī)格適合分離不同分子量的物質(zhì) 98 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 交聯(lián)葡聚糖凝膠的性質(zhì) 99 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 (2)羥丙基葡聚糖凝膠 (sephadex LH20)：為 sephadex G25經(jīng)羥丙基化處理后得到的產(chǎn)物。商品型號(hào)即按交聯(lián)度大小分類，并以吸水量多少表示。生成的凝膠顆粒網(wǎng)孔大小取決于所用交聯(lián)劑的數(shù)量及反應(yīng)條件。 96 (