細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)ppt課件(參考版)
2025-05-06 03:43本頁面
【正文】 （ 4） 去上清 ， 加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞 。 （ 2） 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上 。 DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。 細(xì)胞凍存方法 1. 預(yù)先配制凍存液： 20%血清培養(yǎng)基 +10% DMSO 2 .取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?, 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（ 1 106 ～ 5 106細(xì)胞 /ml) 3. 加入 1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名 稱和冷凍日期。 低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 ? 在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 ? 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 ? 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。 （ 4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔 OD值（檢測(cè)波長(zhǎng) 570nm）。 操作步驟 （ 1）單細(xì)胞懸液接種于 96孔培養(yǎng)板； 103104細(xì)胞 /孔，每孔培養(yǎng)基總量 200微升（ 96孔培養(yǎng)板每孔容積 370微升）， 37℃ 、 5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間） （ 2）加入 2毫克／毫升的 MTT液（ 50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng) 3小時(shí)。二甲亞砜（ DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。 任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成 ， 從形態(tài)上區(qū)別死 、 活細(xì)胞是困難的 。 7 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 5 吸取 1/10— 1/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。 3 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。常用的消化液有 ％的胰蛋白酶液。 2 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 （ Hela細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。 1 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（ 1000轉(zhuǎn) /分 ）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 慶大霉素：每毫升 100單位 —— 方便、廣譜、穩(wěn)定 完全培養(yǎng)基的組成 ?基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80％ — 95％ ?血清 5％ — 20％ ?碳酸氫鈉 g/L ?青、鏈霉素 各 100U／毫升 培養(yǎng)基的配制 RPMI1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 g 青、鏈霉素 各 100單位／毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌。 通常是 青霉素和鏈霉素 聯(lián)合使用。 ?優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、
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