【正文】 ? DNA分子標(biāo)記輔助育種的原理和方法，以及它的優(yōu)點(diǎn)。 ?分子標(biāo)記用于轉(zhuǎn)基因作物后代 的選擇與檢測(cè) 轉(zhuǎn) Bt基因玉米的 PCR檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)基因親本的 Southern檢測(cè)結(jié)果 1： MK； 2： CK+， Bt質(zhì)粒； 3： CK； 413：轉(zhuǎn)基因親本 分子育種學(xué) 分子標(biāo)記技術(shù) 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 常規(guī)育種技術(shù) 經(jīng)驗(yàn)、機(jī)遇 科學(xué)、技術(shù) 思考題 ? 何謂遺傳圖譜？ ? 簡(jiǎn)述 RFLP、 RAPD、 STS、 SSR、 AFLP標(biāo)記的原理和特點(diǎn)。 分子標(biāo)記在玉米雜種優(yōu)勢(shì)類群中的應(yīng)用 Coefficient huangzao4 pop49 8085 yu871 yu873 p138 xu178 n808 nzong3 hz32 mo17 dan340 zhen22 478 zhen58 k12 huangzao4 16個(gè)常用玉米自交系的聚類圖 Pop49 8085 871 873 p138 許 178 808 綜 3 丹 340 Mo17 HZ32 K12 黃早 4 478 鄭 58 鄭 22 利用特殊配合力對(duì) 16個(gè)自交系進(jìn)行分類結(jié)果 基于 SSR分子標(biāo)記遺傳距離的聚類結(jié)果 85個(gè)自交系 SSR分子標(biāo)記分群結(jié)果 Classification of heterotic groups among 87 inbreds 雜種優(yōu)勢(shì)群 Reid Lancaster 自 330 Zi330 唐四平 頭 溫?zé)? I TrTe I E28群 其他 Total No. 21 12 14 24 12 3 2 我國(guó)目前玉米生產(chǎn)上利用的九種主要 雜種優(yōu)勢(shì)模式： ? Reid 溫?zé)?I ? Reid 自 330 ? Reid 唐四平頭 ? Reid 旅大紅骨 。 CMSTF: 5’CAT GAA ATG GGT GAA GTC TCT TTC3’ CMSTR: 5’AAG AGA AAG GGA GAC TTT GGT CCC3’ CMSCF: 5’ATG CTA ATG GTG TTC CGA TTC C3’ CMSCR: 5’AGC ATC ATC CAC ATT CGC TAG3’ CMSSF: 5’CAA CTT ATT ACG AGG CTG ATG C3’ CMSSR: 5’AGT TCG TCC CAT ATA CCC GTA C3’ 根據(jù)玉米不育系線粒體 DNA的 R區(qū)重復(fù)序列，分別設(shè)計(jì)了玉米 T、 C和 S三種不育胞質(zhì)的特定引物，可以通過(guò) PCR的方法準(zhǔn)確鑒定雜交種中不育胞質(zhì)雜交種的類型及比例。 （三）單目標(biāo)分子標(biāo)記輔助選擇 七、分子標(biāo)記用于作物遺傳多樣性分析 1. 品種鑒定 2. 遺傳多樣性分析 ? 分子標(biāo)記在種子生產(chǎn)中的應(yīng)用 品種鑒定 Hu和 Quiros等（ 1991）利用 4個(gè)隨機(jī)引物鑒別 14個(gè)青花菜和 12個(gè)花椰菜品種；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)現(xiàn)利用一個(gè)引物 OPP09可把 9個(gè)棉花品種區(qū)分開(kāi)。這樣，分子標(biāo)記篩選后，仍有遺傳多樣性豐富的群體供育種家通過(guò)傳統(tǒng)育種方法選擇，產(chǎn)生新的品種和雜交種。 ? Stuber等（ 1995）利用分子標(biāo)記技術(shù)將決定玉米高產(chǎn)的主效基因從自交系 TX303轉(zhuǎn)移到 B73中，從自交系OH43中轉(zhuǎn)移到 MO17中，育成了新自交系 “ 增強(qiáng) B73”和“ 增強(qiáng) MO17”，二者配制的雜交種在兩年的實(shí)驗(yàn)中，較對(duì)照增產(chǎn) 15%。 打破目標(biāo)性狀間的負(fù)相關(guān) （二）、 QTL(Quantitative Trait Locus)的選擇 ? 作物的許多重要農(nóng)藝性狀大多由數(shù)量性狀基因控制，通過(guò) QTL分析，可尋找出決定 QTL的主效基因緊密連鎖的分子標(biāo)記用于 MAS。 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花育種研究室（ 1998）利用洞 A核雄性不育系拓建了我國(guó)抗黃枯萎病品種的輪回選擇基礎(chǔ)群體，并將抗病、抗蟲(chóng)、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等不同品系與該群體雜交，利用 MAS快速獲得了高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲(chóng)的棉花新品系。 國(guó)際水稻所的黃寧等人（ 1998）利用分子標(biāo)記技術(shù)已將抗白葉枯病基因 xa Xa xa13和 Xa21精確定位，并通過(guò)聚合雜交、分子標(biāo)記輔助選擇獲得 4個(gè)抗白葉枯病基因壘集到 IR24的同一個(gè)單株中。這不僅技術(shù)要求高、消耗人力和時(shí)間，而且局限于在高世代穩(wěn)定品系鑒定時(shí)使用，對(duì)早代分離群體中的單株選擇鑒定很難進(jìn)行。 ? 基因聚合 （一）、目標(biāo)質(zhì)量性狀的選擇 例 2：水稻白葉枯病有許多個(gè)生理小種，而不同的生理小種的抗病表現(xiàn)型是相同的。當(dāng)達(dá)到250個(gè)以后，其變異系數(shù)就基本上不再變化。 ? 具體篩選時(shí)是逐條染色體均勻地進(jìn)行，直到所需要的量為止。 ? 一般來(lái)說(shuō)，針對(duì)供體親本進(jìn)行遺傳背景清除，需要有 250個(gè)左右能覆蓋全基因組的有多態(tài)性的分子標(biāo)記（見(jiàn)左圖），并在每條染色體上均勻地分布，具體數(shù)目可以隨基因組大小的不同而有所差異； ? 雜交親本間分子標(biāo)記多態(tài)性頻率的高低主要與所用親本的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近有關(guān)。 II、利用 MAS技術(shù)進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育的基本程序 合適分子標(biāo)記的選擇 親本多態(tài)性篩選 目標(biāo)性狀的間接選擇 輪回親本的遺傳背景的恢復(fù) 合適分子標(biāo)記的選擇 ? 針對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行間接選擇的分子標(biāo)記，只要與目標(biāo)基因緊密連鎖，原則上可選用任何一種分子標(biāo)記進(jìn)行，但以易于檢測(cè)、重演性好的為佳，如 SSR， AFLP， RFLP等。 所謂遺傳累贅即目標(biāo)性狀與不良性狀緊密連鎖，并一起導(dǎo)入受體基因組，導(dǎo)致改良的品種與預(yù)期目標(biāo)不一致的現(xiàn)象。 （三）、選用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記 ? 如利用目標(biāo)性狀左右兩側(cè) 1cM之內(nèi)的分子標(biāo)記只需 2個(gè)世代就能從分離群體中找到供體 DNA片段最小但攜帶有目標(biāo)基因的個(gè)體；而傳統(tǒng)的方法可能需要 815代才能辦到。當(dāng)將兩個(gè)標(biāo)記同時(shí)使用時(shí)，其選擇效果與單獨(dú)使用標(biāo)記 2的效果一致。利用 標(biāo)記 1進(jìn)行群體選擇時(shí) ,含標(biāo)記 1中選植株中 ,純合抗病株、雜合體和純合感病株分別占 %、 %和 %。 實(shí)例： ? 如 Haley(等 1994）找到與菜豆普通花葉病毒隱性抗病基因 bc3連鎖的兩個(gè) RAPD分子標(biāo)記，其中 標(biāo)記 1與bc3相引 ，距離為 。 原因：通過(guò)相斥標(biāo)記的選擇，可將群體中含標(biāo)記的不含目標(biāo)性狀的純合體和含目標(biāo)性狀的雜合體植株全部剔除，僅剩下無(wú)標(biāo)記的含目標(biāo)性狀的植株。所謂相斥連鎖即有分子標(biāo)記，植株不表現(xiàn)目標(biāo)性狀；無(wú)分子標(biāo)記，植株表現(xiàn)目標(biāo)性狀。兩人僅用了一個(gè)月時(shí)間就從 BC2F1的2300個(gè)單株中選出 300個(gè)目標(biāo)單株。 ? 優(yōu)點(diǎn)：降低成本，節(jié)約篩選時(shí)間，提高選擇效率。 三、提高分子標(biāo)記的篩選效率 （一）、多重 PCR法 （二）、相斥相分子標(biāo)記選擇法 （三）、選用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記 （一）、多重 PCR法 ? 技術(shù)原理：即利用多對(duì)引物在同一反應(yīng)條件下同時(shí)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 MAS應(yīng)用實(shí)例 Stuber等（ 1995）利用 MAS將決定玉米高產(chǎn)的主效基因從自交系 TX303轉(zhuǎn)移到 B73， OH43轉(zhuǎn)移到 Mo17，育成的新自交系“增強(qiáng) B73”和“增強(qiáng) Mo17”，二者配制的雜交種較對(duì)照增產(chǎn) 15%。l； ③ 瓊脂糖凝膠可反復(fù)多次使用， EB染膠觀察可在反應(yīng)管中直接進(jìn)行 ； ④ 改 EB染色為甲烯籃染色，該 UV觀察為可見(jiàn)光觀察，減少人體傷害 。 2. 降低成本辦法 ① 發(fā)展和應(yīng)用 DNA微量快速提取技術(shù)， 只要能提取 DNA，盡量使用廉價(jià)藥品； ② 減少 PCR反應(yīng)體積，如從每管 25181。所用分子標(biāo)記類型最好是 PCR標(biāo)記； ③ 檢測(cè)技術(shù)在不同的實(shí)驗(yàn)室或研究者間應(yīng)有很高的重復(fù)性，且經(jīng)濟(jì)實(shí)用； ④ 最好有一套能準(zhǔn)確進(jìn)行數(shù)據(jù)分子的統(tǒng)計(jì)軟件。 QTL detected for grain yield QTL detected for ear length QTL detected for kernels weight QTL detected for row number Note: ?分子標(biāo)記輔助選擇 第四節(jié) 分子標(biāo)記技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用 一、分子標(biāo)記輔助選擇（ marker assisted selection, MAS）的遺傳基礎(chǔ)和應(yīng)具備的條件 1. 遺傳基礎(chǔ) 以 RFLP標(biāo)記輔助選擇抗病基因 (R)為例： 標(biāo)記基因型 P1…M P2…m F1…Mm F2…MM Mm mm 在 MM群體中大多數(shù)個(gè)體由于連鎖攜帶抗 基因 R，若重組值為 P，當(dāng)基因純合時(shí)，則 RR 概率為 ( 1— P )2 Rr 概率為 2P（ 1— P） rr 概率為僅為 P2 即重組值越小，其錯(cuò)選率越低 P1 P2 x MR MR mr mr _ – MR mr _ – F1 F2 MR MR MR mr mr mr _ _ – RR Rr rr 利用 MAS的遺傳基礎(chǔ) M R m r 供體 受體 目標(biāo)基因與 DNA標(biāo)記間的遺傳距離為 p 一 一 m r 一 一 親本中 DNA標(biāo)記的帶型 F1雜種中 DNA標(biāo)記的帶型 一 一 一 一 ? M R 在 F2分離群體中分子標(biāo)記類型，即 MM、 Mm和 mm型 在分子標(biāo)記為 MM群體中，大多數(shù)個(gè)體由于連鎖應(yīng)攜帶該抗病基因 R，若重組值為 p，其基因型純合時(shí)，即 RR的概率為 （ 1p） 2，雜合基因型 Rr的概率為 2p（ 1p） ，而錯(cuò)選率 rr僅為 p2。如 QTL的遺傳力為 10%，標(biāo)記間距 15cM，則樣本容量 300就可保證 QTL的發(fā)現(xiàn)能力達(dá) 80%以上。同時(shí) ,QTL作圖一般要經(jīng)過(guò)