【正文】 ☆ 終止子（ terminator）：在轉(zhuǎn)錄的過程中，提供轉(zhuǎn)錄終止 信號的 RNA序列 真正起終止作用的是 RNA序列－－－與啟動子不同 ☆ Euk. 都具有－－－－一種基因表達調(diào)控的手段 一、原核生物的終止子 終止子的種類 （ 1） 內(nèi)在終止子（不依賴 ρ因子的終止子） 體外實驗中，只有核心酶和終止子就足以使轉(zhuǎn)錄終止 （ 2） 依賴 ρ因子的終止子 蛋白質(zhì)輔助因子－－ ρ因子 存在時，核心酶。約 1/3的 poly(A)－ mRNA編碼了不同形式的組蛋白，其余 2/3的 poly(A)－ mRNA帶有與 poly(A)+組分相同的遺傳信息。 poly(A)尾巴的功能 是 mRNA由細胞核進入細胞質(zhì)所必需的形式，提高了 mRNA在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性 廣泛應(yīng)用于分子克隆。 ? RNA聚合酶 Ⅱ 在 poly(A)起始位點不終止而繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，大部分基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擁有poly(A)位點下游 ～ 2kb核苷酸序列。 ? 點突變實驗將 AAUAAA的基因序列變?yōu)?AAGAAA，發(fā)現(xiàn) mRNA的剪接加工受阻，沒有功能性 mRNA產(chǎn)生。 ? poly(A)序列是在轉(zhuǎn)錄后加上去的，是在細胞核中的不均一核 RNA階段加上的。有這個甲基的結(jié)構(gòu)稱為 1號帽子 (cap1)，真核生物中以這類帽子結(jié)構(gòu)為主 在某些生物細胞內(nèi)， mRNA鏈上的第三個核苷酸的 2′ OH位也可能被甲基化，被稱為 2號帽子（ cap2），占有帽mRNA總量的 10%～ 15%。 mRNA的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化。新加上的 G與 mRNA鏈上所有其他核酸苷方向正好相反，像一頂帽子倒扣在 mRNA鏈上。據(jù)測算，在新生 mRNA鏈達到 50個核苷酸之前，帽子結(jié)構(gòu)就已加到mRNA的第一個核苷酸上了。其 5′ 端并不產(chǎn)生預(yù)期的核苷三磷酸，而產(chǎn)生以 5′→ 5′ 三磷酸基團相連的二核苷酸，5′ 終端是一個在 mRNA轉(zhuǎn)錄后加上去的甲基化鳥嘌呤 。 一個完整的基因，不但包括編碼區(qū) (coding region)，還包括不編碼氨基酸的 5′ 和 3′ 端的特異性序列。 SD序列 真核生物 mRNA的特征 凡是編碼功能蛋白的真核基因都通過 RNA聚合酶 Ⅱ 進行轉(zhuǎn)錄。 ? 對于多順反子 mRNA中的第一個順反子來說，一旦 mRNA的5′ 端被合成，翻譯起始位點即可與核糖體相結(jié)合，而后面幾個順反子翻譯的起始就會受其上游順反子結(jié)構(gòu)的調(diào)控。 許多原核生物 mRNA以多順反子的形式存在 ? 所有 mRNA都被分成 3部分 :編碼區(qū) 、 位于 AUG之前的 5′ 端上游非編碼區(qū) 以及 位于終止密碼子之后不翻譯的 3′ 端下游非編碼區(qū) 。這一組基因被稱為一個操縱子。編碼多個蛋白質(zhì)的 mRNA為多順反子 mRNA。我們所討論的 mRNA的半衰期只是統(tǒng)計學(xué)上的平均值。mRNA降解的速度大概是轉(zhuǎn)錄或翻譯速度的一半。 mRNA的半衰期短 ? 絕大多數(shù)細菌 mRNA的半衰期很短，mRNA的降解緊隨著蛋白質(zhì)翻譯過程發(fā)生。 真核細胞 mRNA的合成和功能表達發(fā)生在不同的空間和時間范疇內(nèi) 原核生物中， mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個細胞空間里，而且這兩個過程幾乎是同步進行的，蛋白質(zhì)合成往往在 mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時就被引發(fā) 一個原核細胞的 mRNA(包括病毒 )有時可以編碼幾個多肽，而一個真核細胞的 mRNA最多只能編碼一個多肽 原核生物常以 AUG作為起始密碼子，有時 GUG或 UUG也作為起始密碼子；真核生物幾乎永遠以 AUG作為起始密碼子 原核生物 mRNA的特征 細菌基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯是緊密相聯(lián)的，基因轉(zhuǎn)錄一旦開始，核糖體就結(jié)合到新生 mRNA鏈的 5′ 端，啟動蛋白質(zhì)合成，而此時該 mRNA的 3′ 端還遠遠沒有轉(zhuǎn)錄完全。 ? mRNA在所有細胞內(nèi)執(zhí)行著相同的功能，即通過密碼三聯(lián)子翻譯生成蛋白質(zhì)，但其生物合成的具體過程和成熟 mRNA的結(jié)構(gòu)在原核和真核細胞內(nèi)是不同的。 ? 現(xiàn)已清楚，許多基因的 mRNA在體內(nèi)還是相當(dāng)穩(wěn)定的，半衰期從 幾個小時到幾天不等 。 RNAPol RNAPol RNAPol 核小體 轉(zhuǎn)錄延長中的核小體移位 轉(zhuǎn)錄方向 —— 和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān) Poly (A) mRNA 核酸酶 AATAAA GTGTGTG 轉(zhuǎn)錄終止的修飾點 5’ 5’ 3’ 3’ RNApol （三）轉(zhuǎn)錄終止 原核生物與真核生物 mRNA的特征比較 mRNA在大腸桿菌細胞內(nèi)占總 RNA的 2%左右(tRNA占 16%，而 rRNA則占 80%以上 )。 RNApol前移處處都遇上核小體。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活性和專一性的復(fù)合物，再與 RNA聚合酶搭配而有針對性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。 參與 RNApol Ⅱ 轉(zhuǎn)錄的 TFⅡ 轉(zhuǎn)錄因子 亞基和 (或 )分子量（ kDa） 功能 TFⅡ D TBP， 38 結(jié)合 TATA盒 TAF 輔助 TBPDNA結(jié)合 TFⅡ A 12， 19， 35 穩(wěn)定 Ⅱ DDNA復(fù)合物 TFⅡ B 33 促進 RNApolⅡ 結(jié)合 TFⅡ F 30， 74 解螺旋酶 TFⅡ E 57(?)， 34(β ) ATPase TFⅡ H 蛋白激酶，使 CTD磷酸化 3. 轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物 (preinitiation plex, PIC) 真核生物 RNApol不與 DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。 轉(zhuǎn)錄起始點 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增強子 順式作用元件 (cisacting element) 1. 轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段 AATAAA 切離加尾 轉(zhuǎn)錄終止點 修飾點 外顯子 翻譯起始點 內(nèi)含子 OCT1 OCT1： ATTTGCAT八聚體 2. 轉(zhuǎn)錄因子 能直接或間接辨認和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段 DNA的蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為 反式作用因子(transacting factors)?；蜣D(zhuǎn)錄 實際上是 RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果。有些基因，如組蛋白 H2B，不含 GC區(qū)，但有兩個 CAAT區(qū)，一個 TATA區(qū)。 ? 盡管這 3種啟動子區(qū)序列都有著重要功能，但并不是每個基因的啟動子區(qū)都包含這 3種序列。 ? CAAT區(qū)對 轉(zhuǎn)錄起始頻率 的影響最大，該區(qū)任一堿基的改變都將極大地影響靶基因的轉(zhuǎn)錄強度，而啟動區(qū)其他序列中一兩個堿基的置換則沒有太大的影響。 ? TATA區(qū)和其他兩個 UPE區(qū)的作用有所不同。真核基因的調(diào)控區(qū)較大， TATA A/TA區(qū)位于 20～ 30，而 40～ 110區(qū)為上游激活區(qū)。 ? 原核和真核基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游區(qū)的結(jié)構(gòu)存在很大的差別。簡單地說，真核基因的啟動子在25～ 35區(qū)含有 TATA序列， 在 70～ 80區(qū)含有CCAAT序列 (CAAT box)，在 80～ 110含有GCCACACCC或 GGGCGGG序列 (GC box)。 由于該序列前 4個堿基為 TATA，所以又 稱為 TATA區(qū) (TATA box)。 真核生物啟動子對轉(zhuǎn)錄的影響 ? 啟動子是確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的 DNA序列。 而且，無論把這段 72bp序列放在轉(zhuǎn)錄起點上游 1400bp或下游 3300bp處，它都有轉(zhuǎn)錄增強作用。后來在許多基因的啟動區(qū)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了增強子的存在。例如，在乳糖操縱子的啟動子中，將其 Pribnow區(qū)從TATGTT變成 TATATT，就會提高啟動子的效率，提高乳糖操縱子基因的轉(zhuǎn)錄水平。 細菌中常見兩種啟動子突變 下降突變 (down mutation) 上升突變 (up mutation) 如果把 Pribnow區(qū)從TATAAT變成 AATAAT就會大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平 。 的變化）所產(chǎn)生的 超螺旋會發(fā)生改變。 10區(qū)和 35區(qū)的最佳間距 ? 在原核生物中， 35區(qū)與 10區(qū)之間的距離大約是 16～ 19bp ?保持啟動子這二段序列以及它們之間的距離都是重要的，否則就會改變它所控制基因的表達水平。 因此， RNA聚合酶既是雙鏈 DNA結(jié)合蛋白，又是單鏈 DNA結(jié)合蛋白。解鏈區(qū)一般在 9～ +13之間 ，而酶與啟動子結(jié)合的主要區(qū)域在其 上游 。由于它們分別處于 DNA雙螺旋的 大溝或小溝內(nèi) ，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有處于特定空間構(gòu)象的氫鍵受體與供體，當(dāng)它們與啟動子中對應(yīng)的分子在一定距離內(nèi)互補時，就形成氫鍵，相互結(jié)合。 兩種復(fù)合物均為二元復(fù)合物（全酶和 DNA ） c. 在開放型的啟動子復(fù)合物中， RNApol的 I位點和 E位點的 核苷酸前體間形成第一個磷酸二酯鍵（ β 亞基） 三元復(fù)合物形成 +1位多為 CAT模式 ,位于離開保守 T 6~9 個核苷酸處 69 bp G C T A TTGACA TATAAT 1618 bp +1 35 sequence 10 sequence （ 4） σ因子解離 → 核心酶與 DNA的親和力下降 起始過程結(jié)束 → 核心酶移動進入延伸過程 轉(zhuǎn)錄的起始過程 σ 核心酶 12～ 17bp （ β亞基） CAPcAMP 結(jié)合位點 （也稱 CAP位點） 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中， I → 阻遏蛋白 → 負調(diào)控 lac 操縱子模型 I 許多基因的表達還存在正調(diào)控機制 例如 : 培養(yǎng)基中乳糖和葡萄糖共存時 → 只有葡萄糖被 利用 原因： CAP位點的正調(diào)控 ? 葡萄糖缺少時 ，腺苷酸環(huán)化酶將 ATP → cAMP ， cAMP與 CAP位點結(jié)合 ,此時啟動子的進入位點才能 與 RNApol結(jié)合 ? 葡萄糖存在時， cAMP不能形成，沒有 CAP－ cAMP 與 CAP位點結(jié)合，啟動子的 RNApol進入位點不能結(jié) 合 RNApol 因此 ,一個操縱元中有兩道控制開關(guān) ,只有同時打開 ,結(jié)構(gòu)基因才 能進行轉(zhuǎn)錄。 RNApol的一個適合位點到達－ 10序列區(qū)域，誘導(dǎo)富 含 Pribnow 框的“熔解”， 形成 12－ 17bp的泡狀 物，同時酶分子向－ 10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合 167。 一致序列： T80A95T45A60A50T96 （ TATPUAT） 167。 位置在不同啟動子中略有變動 （ 2） Pribonow 框（ Pribonow Box） 167。 大多數(shù)啟動子中共有序列為 T82T84G78A65C54A45 167。 35序列， RNA聚合酶的松弛（ 初始 ）結(jié)合位點， 167。 因此，聚合酶全酶的作用是啟動子的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，而核心酶的作用是鏈的延伸。 二是盡快釋放 σ 亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過上游啟動子區(qū)并生成由核心酶、 DNA和新生 RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物 轉(zhuǎn)錄的真實性取決于 有特異的轉(zhuǎn)錄起始位點 轉(zhuǎn)錄起始后按照堿基互補原則準確地轉(zhuǎn)錄 模板 DNA序列及具有特異的終止部位 σ 因子 ? 只有帶 σ 因子 的全酶才能專一地與 DNA上的啟動子結(jié)合， 選擇其中一條鏈作為模板， 合成均一的產(chǎn)物。 強啟動子 封閉復(fù)合物 開放復(fù)合物（不可逆的快反應(yīng)） 真核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的分子量很大： RNA聚合酶、7種輔助因子（包含多個亞基）。 ? 真核生物 RNA聚合酶一般有 8～ 14個亞基 所組成，相對分子質(zhì)量 超過 5 105。 RNA合成過程 起始 雙鏈 DNA局部解開 磷酸二酯鍵形成 終止階段 解鏈區(qū)到達基因終點 延長階段 5? 3? ? ? RNA 啟動子（promotor)