現(xiàn)代酶工程ppt課件(參考版)
2025-01-08 13:20本頁面
【正文】 ? 對家族基因重排中得到的最好克隆子進行進一步研究表明它含有來源于 4個不同親本中 3個親本的 8個片段， 7個交叉的地方都發(fā)生在序列同源的區(qū)域，并且這個最好的克隆子含有高達 33個的點突變。同樣選出 50000個克隆子移入含羥羧氧酰胺頭孢菌素的平板，從中篩選出的最好的克隆子，與抗性較強的親本相比，其抗性增加了 270倍（從 200μg/ml ）；與抗性較弱的親本相比，其抗性增加了 540倍（從 ）。從平板上篩選得到的最好的突變子，它對羥羧氧酰胺頭孢菌素的抗性相對于親本來說大約增加了 8倍。它們的 DNA同源性很低，從 58%到 82%不等。 這種高頻率、高密度的交叉水平是 DNAshuffling所難以達到的 。 其中的懸垂切割步驟使短片段 (比 DNase消化片段還短 )得以重組，明顯提高了重組頻率；如果在片段重組前后采用錯誤傾向 PCR還可引入額外點突變 。此方法省去了將 DNA酶切成片段這一步，因而簡化了 DNA重排方法。在一個PCR反應(yīng)體系中以兩個以上相關(guān)的 DNA片段為模板進行 PCR反應(yīng)。 ? 與 DNA shuffling相比， RPR具有以下優(yōu)點： a．用單鏈 DNA為模板．對模板量要求少，大大降低了親本組分， 便利篩選 b．克服了 DNA shuffling中片段重新組裝前必須徹底去除 DNase I的缺點 c．片段組裝體系與片段合成體系緩沖系統(tǒng)可兼容，組裝前無需純化操作 d．隨機引發(fā) DNA合成不受模板 DNA長度的限制，便利了小肽的改造 隨機引 導(dǎo)重組(RPR) 交叉延伸程序 （ Staggered extension process， StEP） 交叉延伸程序（ Staggered extension process，StEP）是一種簡化并改進的 DNA重排技術(shù)。當(dāng)然，錯配率并不是越高越好，一般認為，理想的突變頻率為每個基因 ~5個點突變。這樣，由于 Taq DNA聚合酶缺乏校對活性，其錯配率會大大增加，通?？梢赃_到每千堿基對 1個突變左右。 易錯 PCR（ errorprone PCR，簡稱 EPPCR） 利用 PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯配對特定基因進行隨機誘變的技術(shù)稱為易錯 PCR（ errorprone PCR，簡稱 EPPCR）。這樣，帶有定點突變基因的噬菌體比例可顯著提高。因此，利用 dut – ung –菌株制備的 M13載體中，大約 1%的 T被 U取代。 dut基因編碼催化 dUTP 分解的 dUTPase，該基因缺陷會使細胞中 dUTP含量升高，導(dǎo)致復(fù)制時少量 dUTP代替 dTTP摻入 DNA。 此后，研究者又設(shè)計出很多方法以提高定點突變的頻率，其中比較常用的 Kunkel提出的一種配合該技術(shù)的誘變體產(chǎn)量富集法。但是，由于許多技術(shù)上的原因，實際上一般只有 1%到 5%的克隆帶突變基因。 Smith后來還因為此項研究與 PCR的發(fā)明者 Mullis共享了 1993年的諾貝爾化學(xué)獎。 最早的通用性定點突變技術(shù)是由 M.
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